脯氨酸含量的测定
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脯氨酸含量的测定
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脯氨酸含量的测定
在逆境条件下,植物体内脯氨酸(proline,Pro)的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外,由于脯氨酸亲水性极强,能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程,因而能降低凝固点,有防止细胞脱水的作用。在低温条件下,植物组织中脯氨酸含量增加,可提高植物的抗寒性,因此,亦可作为抗寒育种的生理指标。
一、原理
当用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即为红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色,从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
待测植物叶片
(二)仪器设备
1. 722型分光光度计;
2.研钵;
小烧杯;
4.容量瓶;
5.大试管;
6.普通试管;
7.移液管;
8.注射器;
9.水浴锅;
10.漏斗;
11.漏斗架;
12.滤纸;
13.剪刀。
(三)试剂
1.酸性茚三酮溶液:将茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/l 磷酸中,搅拌加热(70℃)溶解,贮于冰箱中。
2. 3%磺基水杨酸:3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。
3.冰醋酸。
4.甲苯。
三、实验步骤
1.标准曲线的绘制
(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸,倒入小烧杯中内,用少量蒸馏水溶解,然后倒入250ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。
(2)系列脯氨酸浓度的配置:取6个50ml容量瓶,分别加入脯氨酸原液、、、、及,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,各瓶的脯氨酸浓度分别为
1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml及6ug/ml。
(3)取6支试管,分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加热30min。
(4)冷却后各试管准确加入4ml甲苯,振荡30s,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。
(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中,以甲苯溶液为空白对照,于520nm波长处进行比色。
(6)标准曲线的绘制:先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式,再按回归方程式绘制标准曲线,计算2ml测定液中脯氨酸的含量(ug/2ml)。
2.样品的测定
(1)脯氨酸的提取:准确称取不同处理的待测植物叶片各,分别置大管中,然后向各管分别加入3%的磺基水杨酸溶液5ml,在沸水浴中提取10min (提取过程中要经常摇动),冷却后过滤于干净的试管中,滤液即为脯氨酸的提取液。
(2)吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中,加入2ml冰醋酸及2ml 酸性茚三酮试剂,在沸水浴中加热30min,溶液即呈红色。
(3)冷却后加入4ml甲苯,摇荡30s,静置片刻,取上层液至10ml离心管中,在3000r/min下离心5min。
(4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯为空白对照,在分光光度计上520nm波长处比色,求得吸光度值。
四、结果计算
根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出)2ml测定液中脯氨酸的含量(X,ug/2ml),然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下:
单位鲜质量样品的脯氨酸含量(%)=X×Vt
W×Vs×106
x100
式中:X为从标准曲线查出的2ml测定液中脯氨酸的含量(ug/2ml);
Vt为提取液体积(ml);
Vs为测定时取用的样品体积(ml);
W为样品质量(g)。
植物体内硝酸还原酶活力的测定
硝酸还原酶(NR),是植物氮素同化的关键酶,它催化植物体内的硝酸盐
还原为亚硝酸盐,(NO3-+NADH+H+NR
→NO2-+NAD++H2O)。产生的亚硝
酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)α-萘胺(或萘基乙烯二胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰,可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以ug氮/(g·h)为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法操作简单,适合快速、多组测定。离体法复杂,但重复性好。
离体法
一、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
水稻、小麦叶片、幼穗等。
(二)仪器设备
1.冷冻离心机
2.分光光度计
3.天平(感量)
4.冰箱
5.恒温水浴
6.研钵
7.剪刀
8.离心管
9.具塞试管
10.移液管
11.吸尔球。
(三)试剂
1.亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO2 溶于去离子水后定容至1000ml,然后再吸取5ml定容至1000ml,即为含亚硝态氮1ug/ml的标准液。
2. l 的磷酸缓冲液: Na2HPO4·12 H2O与 NaH2PO4·2 H2O加去离子水溶解后定容至1000ml。
3. 1%(质量浓度)磺胺溶液:磺胺溶于100ml 3mol/l盐酸中(25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/l HCl)。
4. %(质量浓度)萘基乙烯胺溶液:萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中,贮于棕色瓶内。
5. l KNO3溶液: KNO3溶于250ml l 的磷酸缓冲液。
6. l 的磷酸缓冲液: Na2HPO4·12 H2O, K2HPO4·3H2O溶于1000ml去离子水中。
7.提取缓冲液:半胱氨酸, EDTA溶于100ml l 的磷酸缓冲液中。
8. 2mg/ml NADH溶液:2mg NADH溶于1ml l 的磷酸缓冲液中(临用前配制)。
二、实验步骤
(一)标准曲线制作
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂,配成0~的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min,然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮(ug)为横坐标(X),吸光度值为纵坐标(Y)建立回归方程。
配置标准溶液时各物质加入量
试剂/ml 管号
1 2 3 4 5 6 7
亚硝酸钠标准液 0
蒸馏水 0
1%磺胺 4 4 4 4 4 4 4
%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4
每管含亚硝态氮/ug 0
(二)样品中硝酸还原酶活力测定