水溶性CdTePCdS量子点荧光探针同步荧光法测定DNA

第52卷第2期　2006年4月武汉大学学报(理学版)J.WuhanUniv.(Nat.Sci.Ed.)Vol.52No.2　Apr.2006,129～132

收稿日期:2005209222 󰂍通讯联系人　E2mail:cai_lin@whu.edu.cn基金项目:国家自然科学基金资助项目(20275027);湖北省教育厅科学技术研究重点项目(D200524005)作者简介:徐　靖(19662),女,博士生,郧阳医学院副教授,现从事动态分子光谱及动力学分析的研究.　E2mail:xujingwh@163.com文章编号:167128836(2006)0220129204

水溶性CdTePCdS量子点荧光探针

同步荧光法测定DNA

徐　靖1,2,赵应声1,吴新国1,蔡汝秀1󰂍

(1.武汉大学化学与分子科学学院,湖北武汉430072;2.郧阳医学院公共与管理学院,湖北十堰442000)

摘　要:以巯基丙酸(HS—CH2CH2COOH)为稳定剂,水相合成了核壳型CdTePCdS量子点(QDs).当固定波

长差为240nm时,CdTePCdS量子点的同步荧光最大发射位于338nm.基于DNA对量子点荧光的猝灭效应,将

CdTePCdS量子点作为荧光探针建立了一种简便快速测定DNA的同步荧光分析法.详细研究了pH值、量子点浓

度、离子强度、温度等条件对量子点同步荧光及DNA测定的影响.该方法测定ctDNA的线性范围为50.0～750.0μg/L,检出限为16μg/L,9次重复测定500μg/LctDNA的相对标准偏差为2.0%.该方法用于合成样品的测定,

结果满意.关　键　词:CdTePCdS;核壳型量子点;DNA;荧光探针;同步荧光

中图分类号:O657.32 文献标识码:A

近年来,半导体量子点(QDs)的研究引起了广

泛的关注[1～4].半导体量子点的激发光谱宽,呈连续

分布,发射光谱对称且半峰宽窄,不同大小的半导

体量子点能被单一波长的光激发而发出不同颜色的

荧光.这就使得在复杂体系中同时研究多种生物分

子成为可能.与传统的有机荧光染料相比,半导体量

子点还具有不易发生光漂白,荧光量子产率高及斯

托克斯位移大等优点,因此可望作为荧光探针应用

于生物体系中[2～5].水相合成的半导体量子点由于

具有良好的亲水性和生物相容性,其合成及应用成

为极具吸引力的研究新热点[6～8].

核酸作为遗传信息的载体,一直是化学和生命

科学中重要的研究领域.核酸的定量分析是核酸研

究的基础.荧光分析法因其简便快速、灵敏度高,成

为核酸分析的最重要手段之一[9,10].由于核酸无内

源荧光,故其测定必须应用量子产率高的荧光探针.

核酸分子的检测灵敏度主要取决于核酸探针的检测

灵敏度.某些能与核酸发生某种嵌插作用的有机染

料如二苯并咪唑、溴化乙啶及其二聚体[10]等常用作

核酸荧光探针.但是有机荧光染料易于发生光漂白

现象,而使其信号强度减弱,从而限制了在痕量核酸

检测中的应用.本文以巯基丙酸(HS—CH2CH2COOH)为稳定剂,水相合成了核壳型CdTePCdS

量子点.核壳体系可以有效地钝化核微粒表面的非

辐射复合中心,减少核心半导体在导带的捕获态,从

而显著提高荧光量子产率,增强光稳定性[11,12].由

于在量子点的外面包覆了一层巯基丙酸,借助于其

外端的羧基,能与生物分子的氨基相作用,从而达

到直接与生物分子结合的目的[6,7].CdTePCdS量子

点具有宽而连续的激发光谱和狭窄对称的发射光

谱,最大发射波长位于578nm.当固定波长差为

240nm时,其同步荧光最大发射位于338nm.与荧

光发射光谱相比,该量子点的同步荧光光谱的峰形

更窄,更对称,荧光强度也更强,与DNA作用后量

子点的同步荧光强度显著降低.基于DNA对量子

点荧光的猝灭效应,将CdTePCdS量子点作为荧光

探针建立了一种简便快速测定DNA的等波长差同

步荧光分析法,并对量子点与DNA之间的结合方

式进行了初步讨论.

1　实验部分

1.1　试剂与仪器

小牛胸腺DNA(ctDNA)为华美公司产品,贮备武汉大学学报(理学版)第52卷

液用pH7.4Tris2HCl缓冲溶液(含0.1mmol/L

EDTA)配制,4℃贮存.实验用水为去离子二次蒸

馏水,其他试剂均为分析纯.

LS55型荧光光谱仪(美国,PE公司),TB285型

恒温水浴(日本,Simadzu公司),pHS23C型精密酸

度计(上海雷磁仪器厂).

1.2　实验方法

1.2.1　CdTePCdS核壳型量子点的制备

参照文献[8],合成了水溶性CdTePCdS核壳

型量子点,并用元素分析、IR(红外)光谱、TEM(透

射电镜)进行表征.

1.2.2　荧光测定

在10mL比色管中依次加入10μL0.1mol/L

CdTePCdS量子点溶液,不同浓度的ctDNA溶液,

用0.05mol/LTris2HCl缓冲溶液定容,于20℃水

浴中温育20min,在Δλ=240nm时,同步扫描激发

和发射单色器,记录338nm波长下QDs的同步荧

光强度.

2　结果与讨论

2.1　反应体系的光谱性质

图1为CdTePCdS量子点的发射光谱(曲线a)

和Δλ=240nm时,体系中加入不同量ctDNA的情

况下获得的同步荧光光谱(曲线b～d).F代表体系

的荧光强度.由图1可知,CdTePCdS量子点的最大

发射波长位于569nm;Δλ=240nm时,同步荧光最

大发射波长位于338nm.比较曲线a～d可以看出,

同步荧光光谱的峰形更窄,更对称,荧光强度也更

强,因此利用量子点的同步荧光测定的灵敏度和选

择性更高.另外,由图1还可以看出,加入DNA后

图1　CdTePCdSQDs的荧光发射光谱(a)和不同

ctDNA浓度下的同步荧光光谱图(b～d)

　曲线b～d对应ctDNA的浓度分别为:0.00,0.10,0.30mg/L;c(QDs)=5.0×10-4mol/L;pH7.40.05mol/LTris2HCl缓冲溶液,Δλ=240nm同步荧光光谱形状不变而强度显著下降.进一步的

实验表明荧光猝灭程度在一定范围内和DNA浓度

成线性关系.基于DNA对量子点荧光的猝灭效应,

本文将CdTePCdS量子点作为荧光探针建立了一

种简便快速测定DNA的同步荧光分析法.

2.2　测定条件的优化

对空白和加入ctDNA后的体系在不同的Δλ

下进行同步扫描,实验结果表明,Δλ=240nm时

CdTePCdSQDs的同步荧光稳定,峰形对称且强度

最大.

2.2.1　反应介质及pH值

试验了几种不同的缓冲体系如:0.05mol/L

KH2PO42Na2HPO4,0.05mol/L柠檬酸2柠檬酸钠,

0.05mol/LTris2HCl,以及不同pH值对测定的影

响,发现只有在Tris2HCl介质中DNA浓度与QDs

的同步荧光强度猝灭有较好的线性关系.在pH6.5

～9.1范围内研究了pH对测定的影响,结果如图2

所示.其中,F0表示无DNA存在时体系的同步荧

光强度).pH为7.4时,DNA对量子点同步荧光的

猝灭效应最强,故测定时选用0.05mol/LpH7.4的Tris2HCl缓冲溶液.

图2　pH值对体系荧光强度的影响

2.2.2　量子点浓度

CdTePCdS量子点浓度c(QDs)(mol/L)以

CdTe分子的浓度计算,其对体系的荧光强度及

DNA的荧光猝灭能力的影响如图3所示.随着

QDs浓度增大,体系的荧光强度增强(曲线a),而

DNA对QDs的荧光猝灭能力减弱(曲线b).考虑

到灵敏度和信噪比,故选择2.0×10-4mol/L为最

适宜的QDs浓度进行测定.

2.2.3　孵育温度和时间

孵育温度和时间对同步荧光强度的影响实验表

明,CdTePCdS量子点的同步荧光强度随温度升高

而降低,在15～22℃之间,荧光强度较为稳定.在

20℃水浴中孵育20min至

38h同步荧光强度稳定031第2期徐　靖等:水溶性CdTePCdS量子点荧光探针同步荧光法测定DNA

图3　CdTePCdS量子点浓度对体系荧光强度(a)及荧光猝灭能力(b)的影响

不变.故测定温度控制在20℃,孵育时间为20

min.

2.2.4　离子强度

离子强度的影响可以区分探针与DNA的结合

方式.用0.1mol/LNaCl溶液调节体系的离子强

度,考察了对同步荧光强度的影响,结果如图4所

示.从图4可以看出,NaCl的加入对CdTePCdS量

子点的同步荧光强度几乎无影响;而当有DNA存

在时,随着NaCl的加入量增大,DNA对量子点同

步荧光猝灭程度减小.说明离子强度影响探针与

DNA的结合.据此可以推测探针与DNA之间的作

用不是嵌入方式.DNA对QDs荧光的猝灭机理尚

有待进一步研究.

图4　NaCl浓度对体系同步荧光强度的影响

　a:c(QDs)=2.0×10-4mol/L;b:c(QDs)=2.0×10-4

mol/L,c(ctDNA)=500μg/L

2.3　体系的分析性能

按实验方法制作标准工作曲线,在50.0～

750.0μg/L范围内,DNA浓度(c(DNA),μg/L)与

对该体系的同步荧光强度猝灭值(ΔF)有良好的线

性关系.其线性回归方程为:

ΔF=(52.1272±2.9891)+(347.5269±

5.5676)c(DNA),r=0.992(n=9)方法检出限经Sb/k经验公式计算为16μg/L.

其中,Sb为空白的标准偏差,k为线性校正斜率.对

浓度为500μg/L的DNA进行9次平行测定的相

对标准偏差为2.0%,表明方法的重现性好,精密度

高.

2.4　干扰离子的影响

在测定500μg/LDNA时(相对标准偏差≤

±5%),考察了多种可能的共存物质:氨基酸、碱基、

无机离子等的干扰情况.其允许倍率分别为:500倍

的葡萄糖、果糖、苯丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、

胱氨酸、半胱氨酸,100倍的胸腺嘧啶、黄嘌呤和10

倍的常见金属离子Na+、K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+及

Cl-不干扰测定.Cu2+、PO3+4干扰较严重,对量子点

的荧光有较强的猝灭作用.

2.5　合成样品分析

按照实验方法对合成样品进行了测定,结果见

表1.表中数据为5次平行测定结果.合成样品中分

别含有1.0mg/LNa+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、葡萄糖

(Glucose)、甘氨酸(Glycin)、胸腺嘧啶(Thymine)、

黄嘌呤(Xanthine).分析结果表明测定值与理论值

相当吻合,回收实验及测定的相对标准偏差结果满

意.因此,可以确定该方法测定DNA具有可行性.

表1　合成样品的测定

编号加入量/μg・L-1回收量/μg・L-1回收率/%RSD/

%1100.0101.8101.82.22500.0493.598.72.01

3　结　论

本文建立了一种以水溶性CdTePCdS核壳型

量子点作为荧光探针测定DNA的新方法.在中性

介质(pH7.40.05mol/LTris2HCl)中,量子点的

同步荧光猝灭与DNA浓度呈线性关系.该方法除

具有简单快速、灵敏度高等优点外,由于量子点荧光

探针Stokes位移大,激发峰宽,可以避免生物体系

的背景干扰.量子点优越的荧光特性及合适的空间

尺度,结合荧光光谱、荧光偏振、能量转移等技术和

方法,在研究生物大分子的结构、功能以及相互作用

等方面具有独特的优势.对水溶性量子点荧光探针

的深入研究可以拓展纳米材料在分析化学和生命科

学中的应用领域.

参考文献:

[1]　GaoMY,KirsteinS,MhwaldH,etal.StronglyPho2131