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临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识近年二代基因测序( next-generation sequencing ，NGS)技术快速发展，其应用已进展至临床检测，如遗传疾病、实体肿瘤、血液肿瘤、感染性疾病、人类白细胞抗原分析及非侵袭性产前筛查等。
国内外有关学会已出台相关共识与指南以推动其在临床中的应用。
中华医学会病理学分会和中国抗癌协会肿瘤病理专委会前期组织病理、临床、生物信息等专家进行了充分讨论，拟在NGS 的操作流程、数据处理、结果解读等方面作规范和建议，以规范NGS 在分子病理领域的应用。
临床分子病理实验室NGS 样本可采用甲醛固定石蜡包埋组织(formalin-fixedparaffin-embedded ，FFPE)新鲜组织、各种体液上清液、体液离心细胞块、石蜡包埋标本和血浆/血液标本等。
本共识特色是基于病理评估的组织样本(FFPE新鲜)的规范。
测序分析范围基于目前临床需求，本共识着重在于目标区域测序( panel )分析的实践。
随着技术的更新和应用的成熟，本共识将持续更新以满足临床需求。
一、实验室总体要求NGS 检测实验室的总体设计与要求应参考《分子病理诊断实验室建设指南(试行) 》《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》、《个体化医学检测质量保证指南》、《肿瘤个体化治疗检测技术指南》、《个体化医学检测实验室管理办法》、《测序技术的个体化医学检测应用技术指南（试行）》进行。
1.NGS检测人员的资质要求：NGS检测技术人员应具备临床病理学、分子生物学的相关专业大专以上学历，并经过NGS 技术的理论与技能培训合格。
数据分析人员应具有临床医学或分子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培训。
最终报告应由中级或硕士以上具有病理学背景、经培训合格的本单位执业医师或者授权签字人（医学博士学位或高级职称）审核。
2.NGS检测实验室的区域设置要求：原则上NGS实验室应当有以下分区：样本前处理区、试剂储存和准备区、样本制备区、文库制备区、杂交捕获区/多重PCR区域（第一扩增区）、文库扩增区（第二扩增区）、文库检测与质控区、测序区、数据存贮区。
二代基因测序流程和试剂的步骤和流程引言二代基因测序是一种高通量、高效率的基因测序技术，能够大规模地获取DNA或RNA的序列信息。
本文将详细描述二代基因测序的流程和试剂的步骤和流程，确保流程清晰且实用。
流程概述二代基因测序的流程可以分为样品准备、DNA或RNA提取、文库构建、聚合酶链式反应（PCR）、测序和数据分析等步骤。
下面将详细介绍每个步骤的具体操作和试剂使用。
1. 样品准备样品准备是整个二代基因测序流程的关键步骤，合理的样品准备可以保证后续步骤的顺利进行。
样品可以是组织、细胞、血液等，需要根据研究目的进行选择。
样品准备的步骤包括：1.1 样品收集根据研究目的选择合适的样品，并采用合适的方法进行收集。
例如，对于组织样品，可以通过手术获取；对于细胞样品，可以通过培养或离心分离等方法获取。
1.2 样品保存采集后的样品需要及时保存，以防止样品质量的降低。
常用的保存方法包括冷冻保存和固定保存。
冷冻保存可以使用液氮保存或低温冰箱保存，固定保存可以使用甲醛等试剂进行固定。
2. DNA或RNA提取DNA或RNA提取是获取样品中的核酸的关键步骤，常用的提取方法包括酚-氯仿法、盐酸法和商用试剂盒法等。
下面以商用试剂盒法为例进行介绍：2.1 样品裂解将样品加入裂解缓冲液中，通过离心等方法使细胞或组织破碎，释放出DNA或RNA。
2.2 蛋白酶处理加入蛋白酶将样品中的蛋白质降解，以便后续纯化DNA或RNA。
2.3 DNA或RNA纯化将裂解液加入商用试剂盒中，通过离心等方法将DNA或RNA与其他杂质分离。
根据试剂盒的不同，可以使用硅胶膜或磁珠等材料进行纯化。
2.4 洗脱DNA或RNA将纯化后的DNA或RNA从硅胶膜或磁珠上洗脱下来，得到纯化后的DNA或RNA。
3. 文库构建文库构建是将提取到的DNA或RNA转化为测序所需的文库，常用的文库构建方法包括PCR文库构建法和片段文库构建法。
下面以PCR文库构建法为例进行介绍：3.1 DNA片段制备将提取到的DNA通过限制性内切酶或超声波等方法制备成适当的片段。
第二章第3节遗传信息的携带者——核酸—、教材分析《遗传信息的携带者——核酸》是人教版高中生物必修一《分子与细胞》第一章第三节的教学内容，主要学习核酸的种类及在细胞中的分布、核酸的结构和功能、学会观察DNA 和RNA在细胞中分布的方法。
本节内容的重点放在细胞层面，让学生了解核酸在细胞中的分布以及核酸能成为遗传信息携带者的原因。
二、教学目标1.知识目标：（1）说出核酸的种类以及核酸在细胞中的分布。
（2）掌握核酸的结构和功能2.能力目标：通过“观察DNA和R NA在细胞中的分布”的实验学会观察细胞中的DNA和RNA的方法。
3.情感、态度和价值观目标：（1）通过“观察DNA和RNA在细胞中的分布”的实验操作，培养学生勇于实践的科学精神和科学态度。
（2）通过分析DNA的结构和功能联系形成结构和功能相统一的观点。
三、教学重点难点重点：核酸的结构和功能。
难点：观察DNA和RNA在细胞中的分布。
四、学情分析我们的学生属于平行分班，没有实验班，学生已有的知识和实验水平有差距。
有些学生对于临时装片的制作都不熟练，所以讲解时需要详细。
五、教学方法1.实验法：观察核酸在细胞中的分布。
2.学案导学：见学案。
3.新授课教学基本环节：预习检查、总结疑惑→情境导入、展示目标→合作探究、反思总结、当堂检测→发导学案、布置预习六、课前准备1.学生的学习准备：预习实验“观察DNA和RNA在细胞中的分布”，初步把握实验的原理和方法步骤。
2.教师的教学准备：多媒体课件的制作，课前预习学案，课内探究血案，课后延伸拓展学案。
3.教学环境的设计和布置：两人一组，实验室内教学。
课前打开实验室门窗通风，课前准备好显微镜、生理盐水、吡罗红甲基绿染色剂、消毒牙签、酒精灯等材料用具。
七、课时安排：1课时八、教学过程（一）预习检查、总结疑惑检查落实了学生的预习情况并了解了学生的疑惑，使教学具有了针对性。
（二）情境导入、展示目标。
利用“问题探讨”唤起学生对遗传物质的记忆，激发学习兴趣。
附件3HIV-2核酸检测1 范围本附件规定了HIV-2核酸检测的意义、实验室要求、检测方法、结果判定及质量控制的要求，适用于具有核酸检测能力的实验室。
2 检测的意义2.1 HIV-2感染诊断当疑似HIV-2感染、HIV-2抗体确证检测结果为不确定，或者需要区分HIV-1和HIV-2感染，需要判定是否为HIV-1/HIV-2双重感染时，可以检测HIV-2核酸进行诊断。
HIV-2前病毒DNA（以下简称DNA）、RNA和总核酸（DNA/RNA）检测结果均可用于HIV-2感染诊断。
HIV-2感染者和艾滋病病人血浆中HIV-2 RNA检出率低，病毒载量水平也低，例如，一个西非的队列研究结果显示，在未接受过抗病毒治疗的HIV-2感染者和艾滋病病人中，血浆HIV-2病毒载量未检出（<10 cps/mL）的占46.5%，病毒载量为10-100 cps/mL、100-1000 cps/mL和>1000 cps/mL的分别占35.8%、11.7%和6.0%。
因此，建议优先选择检测HIV-2 DNA或总核酸。
HIV-2核酸阴性或低于检测限时，不能排除HIV-2感染。
2.2 抗病毒治疗疗效监测适用于已知HIV-2感染者和艾滋病病人。
但因HIV-2 RNA病毒载量水平低，应用价值有限。
3 实验室要求同HIV-1核酸检测和HIV-1基因型耐药检测，功能分区根据所用方法和设备的需要而定。
4 检测方法HIV-2核酸检测包括DNA定性、定量，RNA定性、定量（病毒载量）及总核酸检测。
目前我国还没有HIV-2核酸检测试剂盒获得国家药品监督管理局注册。
今后如有试剂盒获批，使用方法以试剂盒说明书为准。
以下介绍一些实验室自建方法，实际工作中可以根据具体需求选用、调整。
4.1 样本外周血单个核细胞（PBMC）、淋巴细胞富集液和全血等样本可用于HIV-2 DNA或总核酸检测，血浆样本可用于HIV-2 RNA检测。
4.2 核酸提取根据检测目的，选用不同的商品化试剂盒提取核酸，如总核酸提取试剂盒、DNA 提取试剂盒、RNA提取试剂盒。
