工业发酵培养基及制备

实验2灰色链霉菌的活化一、实验目的学习制备高氏一号斜面培养基的方法以及斜面接种技术。

二、实验原理高氏一号斜面培养基是一种合成培养基，用于培养放线菌。

三、实验试剂与仪器1. 菌种：灰色链霉菌；2. 培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，水1000毫升，PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）；3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。

四、实验步骤1. 高氏一号培养基的制备（1）按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000mL。

趁热分装于18mL×180mL试管，斜面以8mL为宜。

（3）分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。

高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。

2. 斜面接种接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。

为了获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作。

一般是在无菌室内，超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。

（1）左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。

（2）左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。

在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。

划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。

注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。

（3）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。

接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。

（4）斜面置于28℃恒温箱中，培养5～6d观察结果。

实验3 灰色链霉菌的摇瓶种子制备一、实验目的学习制备摇瓶种子培养基的方法以及种子扩大培养技术。

菌种选育的必要性和重要性
必要性： • 1、经诱变剂处理的细胞中只有一部分是突变型菌
株，而有害突变往往占有很大比例； • 2、从自然界筛选得来的菌株，药物代谢合成能力
均很低，野生型菌株由于长时间生长在非最适条 件下，产物浓度很低，对于工业生产来说，如果 不进行菌种改良，势必造成生产成本过高。
重要性：
发酵方式
• 1、分批(间歇)发酵：物料一次投入反应器中，灭 菌、接种、发酵。 特点：一次性；发酵过程中，营养不断减少，微生 物不断增殖，环境非稳态；微生物生长的四个时 期明显； 应用广泛，改善（在线检测，计算机控制）。
• 2、补料分批发酵 ：补加新鲜培养基。 特点：可以解除底物抑制、产物抑制或克服微生物 过度生长；提高有用产物的转化率； 应用广泛，用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业；
• 效率低、进展缓慢。
• 2、诱变育种：是用不同的诱变剂（mutagen）处 理微生物的细胞群体，以诱发各种遗传突变，然后 采用简便、快速和高效的筛选方法，从中选出所需 要的突变株（mutant）。发酵工业中使用的高产 菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性 能的菌株，故至今仍是菌种改良的主要方法。
工业发酵的工艺流程
生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种的选 育、菌种培养基的配制、扩大培养和接种、发酵 过程下游处理即分离提纯等几个过程。
一、菌种的选育
找到合适的菌种是发酵工程的前提。人们最初是从自然界寻 找所需要的菌种，如谷氨酸发酵时常用菌有谷氨酸棒状杆菌 等。但这种方法得到的菌种，产量一般都比较低。20世纪40 年代，微生物学家开始用紫外线、激光、化学诱变剂等处理 菌种，使菌种产生突变，以筛选出符合要求的优良菌种。随 着细胞工程、基因工程等技术的日益成熟，科学家开始构建 工程细胞或工程菌，用它们进行发酵，甚至能生产出一般微 生物所不能生产的产品。

发酵培养基的制备和实罐灭菌一、实验目的要求学生掌握通风发酵的基本原理及过程，掌握上罐操作技术，掌握流加补料控制技术。

（1）发酵罐及管路、空气过滤器灭菌操作及发酵罐系统管路的熟悉（2）实罐灭菌—培养基灭菌实验二、实验原理2.1 培养基组分的种类和作用：人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物的营养物质。

主要包括：碳源、氮源、无机盐、生长因子、前体2.2 实罐灭菌原理保温温度（℃）加热保温冷却温度（℃）时间（min）三、实验仪器、设备和材料10升发酵罐（PH仪，培养液及酸碱液流加装置，蠕动泵），1台；淀粉水解糖液、尿素等原料。

四、实验内容与方法：酵母菌经扩大培养后，接入10升机械搅拌通风发酵罐培养，根据实际情况选用分批培养或分批补料培养，测定酵母浓度。

主要内容有：试管斜面培养基的配制、面包酵母种子扩大培养基配制、流加用培养基的配制及灭菌。

总流程：斜面培养基配制与灭菌所需仪器物品：灭菌锅、试管、棉塞、培养基原料、培养箱300毫升种子液、500ml三角瓶三只、装液100ml、培养基、培养摇瓶、纱布。

发酵培养基制备，灭菌。

面包酵母菌的培养基组成：酵母斜面培养基：10º麦芽汁固体斜面，PH5.0酵母摇瓶培养基：10º麦芽汁，PH5.0或葡萄糖10%，玉米浆1%，尿素0.2%，PH5.0酵母分批发酵培养基：玉米淀粉经液化、糖化，折合葡萄糖浓度为10%、玉米浆1%，尿素0.2%，PH5.5。

五、实验报告内容和数据处理实验设计原理；发酵系统的结构与操作方法；实罐灭菌工艺。

附：机械搅拌发酵系统介绍：1 技术指标1.1 概述具有温度、转速、氧气流量、空气流量、pH 、DO 、补料、消泡显示及控制功能，并配有机械消泡浆。

1.2指标1.2.1温度：自动控制范围：自来水温+5℃～ 50℃﹙±0.2 ℃﹚显示范围：0 ～150 ℃1.2.2搅拌转速：调速范围50 ～1000±5rpm1.2.3空气流量：显示控制范围0 ～ 10L/min1.2.4pH显示控制：2 ～12pH±0.05﹙酸碱双向﹚1.2.5溶解氧：0 ～150±2℅1.2.6补料、消泡蠕动泵各一台1.2.7 罐体总容积10L,设计压力2.0kg/c㎡、最高工作压力2.0kg/c ㎡,设计工作温度131 ℃1.2.8 灭菌方法:手动控制蒸汽消毒灭菌1.2.9 功率：主机：3kw, 单相220v1.2.10 气源：2 ～4kg/c㎡1.2.11 蒸汽： 2 ～4kg/c㎡2 管路说明该流程图中空气管路阀门的标号为“AXX”,蒸汽管路阀门的标号为“SXX”，冷却水管路阀门标号为“WXX”，冷凝水管路阀门标号为“VXX”，电磁阀标号为“CXX”，物料管路阀门标号为“PXX”,冷冻水管路标号为“CWX”，其它气体管路标号为“NXX”。

第四章培养基及其制备第一节原料一、原料的定义及选择（一）原料的定义从工艺角度来看，凡是能被生物细胞利用并转化成所需的代谢产物或菌体的物料，都可作为发酵工业生产的原料。

（二）选择原料的依据1，原料选择的原则选择淀粉质原料生产酒精时，从工艺的角度着眼，凡任何含有可发酵性糖或可变为发酵糖的原料，都可作为酒精生产的原料。

对于工业上大规模投入生产的原料，除了要提出工艺上的要求外，还要提出生产管理和经济上的要求，因此，在选择工业上大规模生产酒精的原料时，应考虑到下列诸条件：（1）因地制宜，就地取材，原料产地离工厂要近，便于运输，节省费用。

（2）要求原料内碳水化合物含量较多，蛋白质含量要适当，适合与微生物的需要和吸收利用。

（3）原料资源要丰富，容易收集。

由于酒精生产需要大量原料，要保证一定的库存量。

（4）原料要容易贮藏。

应考虑到新鲜原料内含水量多，不耐久藏，最好选择经，干燥后，含水极少的干原料，易与保藏，不宜霉烂。

（5）对人民的身体无寻损害，影响发酵过程的杂质含量因应当极少，或者几乎不含。

（6）原料价格低廉，可降低产品成本。

此外，还应当考虑到大力节约粮食原料，尽量少用或不用粮食原料，充分利用当地的非粮食原料，广泛利用野生植物原料，同时利用农林副产物和植物纤维原料，以及亚硫酸盐纸浆废液等，对于节约粮食原料有着重要意义。

另外，利用石油原料化学合成制造酒精，也是发展酒精的主要途径。

2，在确定原料选择原则时需注意的问题（1）所选用的培养基与所使用的发酵器的结构有关。

例如ICI公司因指定用甲醇和氨生产单细胞蛋白质而另行设计新的发酵罐。

同样的理由，在一个巳设定的发酵罐中，发酵必然会受到培养基组份改变的影响。

（2）从实验室规模放大到实验工厂规模，以至于放大到工业生产规模，都要考虑培养基的组份的变化。

（3）培养基的组成，除了考虑到菌体生长和产物的形成的需要外，还要考虑到培养基的pH变化、泡沫的形成、氧化还原电位和微生物的形态等，而且还有前体和代谢抑制剂的需要。