DLC-1基因启动子甲基化对于B-ALL的预后价值

匿堂　０　旦　塞　６卷第７期ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｕｌｙ　２０１１，Ｖｏｌ　２６．Ｎｏ　７　

文章编号：１６７３－８６４０（２０１１）０７４）４７３－０６　中图分类号：Ｑ５０３　文献标志码：Ａ　

ＤＬＣ．１基因启动子甲基化对于Ｂ．ＡＬＬ的预后价值　・４７３・　

徐种　，　关　明　，　张健　，　肖艳群　，　陈慧英　，　蒋黎敏　（１．上海市临床检验中心，上海２００１２６；２．复旦大学附属华山医院检验医学科和中心实验室，　

上海２０００４０；３．上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科，上海２００１２７）　

摘要：目的观察儿童急性淋巴细胞白血病中肝癌缺失一１（ＤＬＣ一１）抑癌基因启动子甲基化状态，评估该基因　甲基化对于急性Ｂ淋巴细胞自血病（Ｂ—ＡＬＬ）的预后价值。方法对４Ｏ例Ｂ＿ＡＬＬ患儿ＤＬＣ一１启动子甲基化状态　与白血病敏感预后指标白血病微小残留病灶（ＭＲＤ），以及其他对Ｂ—ＡＬＬ预后可能有影响的指标作一比较，评价　ＤＬＣ．１对于Ｂ—ＡＬＬ的预后判断价值，以及是否可以作为Ｂ．ＡＬＬ的独立预后危险因素。结果ＤＬＣ一１甲基化阳性　的Ｂ．ＡＬＬ患儿的复发率和５年无事件生存率均与ＤＬＣ一１甲基化阴性患儿差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。ＤＬＣ一１　启动子甲基化与ＭＲＤ的结果分布并不一致（Ｐ＞０．０５）。但两者同为阳性结果的５例患儿在５年内全都复发，复　发率为１００％；而两者同为阴性结果的１１例患儿，仅１例在５年内复发，复发率为９％。多因素分析显示仅ＭＲＤ　可作为独立的预后危险因素（Ｐ＝０．０１７），ＤＬＣ一１基因甲基化阳性患儿复发风险是甲基化阴性患儿的８．５倍。结　论ＤＬＣ．１甲基化和ＭＲＤ都是Ｂ．ＡＬＬ有意义的预后指标，两者结合可为临床提供覆盖面更广的预后信息。　ＤＬＣ一１甲基化也显示了该指标有成为独立预后危险因素的趋势。　关键词：ＤＬＣ一１基因；甲基化；急性Ｂ淋巴细胞白血病；预后价值　

Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ＤＬＣ－１　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｂ－ＡＬＬ　ＸＵ　Ｃｈｏｎｇ　，ＧＵＡＮ　凡ｇ　，ＺＨＡＮＧ　Ｊｉａｎ’，ＸＩＡ０　Ｙａｎｑｕｎ　，ＣＨＥＮ　Ｈｕｉｙｉｎｇ　，ＪＩＡＮＧ　Ｌｉｍｉｎ　．　（１．Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００１２６，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈｕａｓｈａｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００４０，Ｃｈｉｎａ；　３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｃｈｉｌｄｒｅｎ　ｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００１２７，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｓｔａｔｕｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｌｅｔｅｄ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｃａｎｃｅｒ一１（ＤＬＣ一１）ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｓｔｉｍａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ｖａｌｕｅ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ　Ｂ—ｃｅｌｌ　ａｃｕｔｅ　ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｂ—ＡＬＬ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ＤＬＣ－－１　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｓｔａｔｕｓ　ｉｎ　Ｂ－－ＡＬＬ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ａｎａｌｙｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ　ａｍｏｎｇ　ＤＬＣ一１　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｓｔａｔｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｒｅｓｉｄｕａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ（ＭＲＤ）ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｏｔｈｅｒ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｆｒｏｍ　４０　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ　Ｂ・ＡＬＬ　ｆｏｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｗｈｅｔｈｅｒ　ｉｔ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ａｎ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　Ｂ－－ＡＬＬ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＤＬＣ・－１　ｇｅｎｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｈａｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｒｅｌａｐｓｅ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｅｖｅｎｔ・－ｆｒｅｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｏｓｅ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ＤＬＣ・１　ｇｅｎｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｒｏｍ　ＤＬＣ一１　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｓｔａｔｕｓ　ａｎｄ　ＭＲＤ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ（Ｐ＞０．０５）．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ａｌｌ　５　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｂｏｔｈ　ＭＲＤ　ａｎｄ　ＤＬＣ一１　ｇｅｎｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｌａｐｓｅｄ　ｉｎ　５　ｙｅａｒｓ（ｒｅｌａｐｓｅ　ｒａｔｅ　１００％）．Ｏｎｌｙ　１　ｃａｓｅ　ｒｅｌａｐｓｅｄ　ｉｎ　５　ｙｅａｒｓ　ｉｎ　１　１　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｂｏｔｈ　ＭＲＤ　ａｎｄ　ＤＬＣ一１　ｇｅｎｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｎｅｇａｔｉｖｅ（ｒｅｌａｐｓｅ　ｒａｔｅ：９％）．Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｏｎｌｙ　ＭＲＤ　ｗａｓ　ａ　ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ（Ｐ＝０．０１７）．Ｔｈｅ　ｒｅｌａｐｓｅ　ｒｉｓｋ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＤＬＣ一１　ｇｅｎｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｗａｓ　８．５　ｔｉｍｅｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ＤＬＣ一１　ｇｅｎｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｂｏｔｈ　ＭＲＤ　ａｎｄ　ＤＬＣ一１　ｇｅｎｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｒｅ　ｇｏｏｄ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｂ—ＡＬＬ．Ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　２　ｍａｒｋｅｒｓ　ｃｏｕｌｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｗｉｄｅｒ　ｃｏｖｅｒａｇｅ　ｏｆ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．ＤＬＣ一１　ｇｅｎｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｌｓｏ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈｅ￣ｅｎｄｓ　ｏｆ　ｂｅｉｎｇ　ａｎ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｄｅｌｅｔｅｄ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｃａｎｃｅｒ一１　ｇｅｎｅ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ；Ｂ—ｃｅｌｌ　ａｃｕｔｅ　ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ；Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ｖａｌｕｅ　

基金项目：上海市自然科学基金资助项目（０８ＺＲ１４１４７００）　

作者简介：徐狮，男，１９７１年生，学士，副主任技师，主要从事免疫学工作。　检验医学２０１１年７月第２６卷第７期Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｕｌｙ　２０１１，Ｖｏｌ　２６　！　

肝癌缺失．１（ｄｅｌｅｔｅｄ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｃａｎｃｅｒ，ＤＬＣ一１）　

基因为抑癌基因之一，其表达可以抑制多种肿瘤　的生长　ｑ　Ｊ。因此，ＤＬＣ．１基因启动子甲基化可　

能成为部分白血病的发病机制中的重要因素。也　

正由于此原因，白血病细胞中ＤＬＣ一１启动子的甲　

基化，在甲基化状态未受纠正的情况下，可能影响　

白血病的预后。白血病微小残留病灶（ｍｉｎｉｍａｌ　

ｒｅｓｉｄｕａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ，ＭＲＤ）是迄今预示白血病复发的　

最敏感的指标，在急性Ｂ淋巴细胞白血病（Ｂ　

ａｃｕｔｅ　ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｂ．ＡＬＬ）中其有效覆　

盖率可达９１．４３％。本研究将ＤＬＣ一１启动子甲基　

化与ＭＲＤ，以及其他对Ｂ—ＡＬＬ预后可能有影响的　

指标作一比较，评价ＤＬＣ．１对于Ｂ—ＡＬＬ的预后判　

断的价值，以及是否可以作为Ｂ—ＡＬＬ的独立预后　

危险因素。　

材料和方法　

一、对象　自２００５年３至６月期间在上海儿童医学中　

心确诊并进入上海儿童医学中，￣－２００５（ＳＣＭＣ一　

２００５）治疗方案的Ｂ—ＡＬＬ患儿４Ｏ例。其中男、女　

各２０例；中位年龄５．５岁（１．５至１６岁）。诊断　

均经ＦＡＢ分型法和流式细胞术免疫分型法确诊，　

并按ＳＣＭＣ－２００５危险度分类标准进行分层治疗，　

其中低危组１８例，高危组２２例。随访截止时间　

为２０１０年６月３１日。　

二、方法　１．细胞形态学检查初诊患者骨髓细胞形　

态学检查按ＦＡＢ分型诊断标准给出诊断意见；诱　

导缓解治疗期间治疗反应的评判方法和标准见帖　

利军等　的方法。　

２．白血病免疫分型采用流式细胞术按文　

献　中的方法进行免疫表型检测。其中，原Ｂ急　

淋（Ｐｒｏ　Ｂ－ＡＬＬ）４例，普通Ｂ急淋（Ｃｏｍｍｏｎ　Ｂ—　

ＡＬＬ）２２例，前Ｂ急淋（Ｐｒｅ　Ｂ－ＡＬＬ）１２例，成熟Ｂ　

急淋（Ｍａｔｕｒｅ　Ｂ．ＡＬＬ）２例。同时，根据是否有　

ＣＤ１３和／或ＣＤ３３表达，分为伴髓系抗原表达　

（Ｍｙ＋Ｂ—ＡＬＬ）和不伴髓系抗原表达（Ｍｙ—Ｂ－　

ＡＬＬ）。　３．白血病微小残留监测　按参考文献　在　

诱导缓解治疗结束达临床缓解（ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ，　ＣＲ）３５ｄ±２ｄ时及以后的持续治疗期间，通过四　色流式细胞术进行ＭＲＤ监测，按结果≥Ｏ．０１％定　

义为阳性。　

４．ＤＬＣ－１基因启动子甲基化检测按参考　文献　７１，初发时患儿的骨髓细胞提取ＤＮＡ，用甲　

基化特异性聚合酶链反应（ｍｅｔｈｙｌｍｉｏｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　

ＰＣＲ，ＭＳＰ）检测ＤＬＣ一１启动子是否存在甲基化，　

并用焦磷酸测序法进行验证。　

三、统计学方法　

无事件生存（ｅｖｅｎｔｓ－ｆｒｅｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ，ＥＦＳ）定义　

为从患者进入本研究开始到任何事件（如复发、　

死亡和第２肿瘤等）发生。如始终无事件发生或　

失访，其ＥＦＳ定义为自进入本研究至最后一次的　

随访时间。生存分析采用Ｋａｐｌａｎ－ｍｅｉｅｒ法，各组　生存率的比较采用ｌｏｎｇ．ｒａｎｋ检验，独立预后因素　

的影响采用ＣＯＸ回归模型分析，以上所有数据均　

用ＳＰＳＳ１３．０系统软件处理。生存曲线图用　

ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　５．０软件绘制。　

结　果　

一、ＤＬＣ一１启动子甲基化检测　

图１显示ＤＬＣ．１基因启动子区引物所在位　

置，ＭＳＰ区域位于启动子区－３４８至一１７７位置；焦　

磷酸测序所用ＰＣＲ扩增片段区域位于启动子区　

－２７６至＋１６位置。采用甲基化引物扩增出的片　

段为１７２ｂｐ，采用非甲基化引物扩增出的片段为　

１７８ｂｐ。ＭＳＰ和焦磷酸测序结果显示４０例Ｂ—ＡＬＬ　

患儿中，ＤＬＣ．１基因启动子甲基化阳性为１５例　

（３７．５％）。ＤＬＣ．１甲基化与患者年龄、性别、白