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western-blot实验方法1、试剂耗材的准备：（1）转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl，39 mM 甘氨酸，0.037% SDS，20%甲醇）：（2）10 ×丽春红染液：（3）TBS 缓冲液：（4）TBST 缓冲液（含20%Tween20 的TBS 缓冲液）：（5）封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液）：（6）一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或TBST 进行稀释。
（7）底物显色液ECL，4℃避光保存，现用现配。
（8）显影液和定影液用水稀释10 - 20 倍于铝盒中，可多次使用。
室温避光存放。
2、实验步骤：（1）蛋白样品制备：用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度。
（2）取1 mg 蛋白进行SDS-PAGE。
（3）转膜：（转膜缓冲液4 ℃预冷备用，冷却装置于- 80 ℃冰箱冷冻备用）。
（4）将2 张海绵垫、2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。
（5）戴上手套，剪一张与凝胶尺寸相近的PVDF 膜（83 mm × 75 mm），左上角剪一缺口作为标记，浸泡在盛有20 mL 甲醇的平皿中约15 sec，直到膜变半透明。
用纯水冲洗膜2 次。
浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。
（6）SDS-PAGE 结束后，小心地剥下两块凝胶，一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。
海绵垫、滤纸、PVDF 膜及凝胶的预平衡时间在15 min - 1 hr 之间。
（7）将转膜夹子打开，使黑的一面保持水平。
按照海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸和海绵垫的先后顺序铺垫，制备凝胶转移夹层。
将膜与凝胶对齐。
用玻璃棒赶走气泡。
（8）将夹子夹起来，扣紧，小心不要移动内层。
放入电转槽中。
使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。
（9）将电转槽放在冰水盒中。
将预冻的冷却装置放入槽内。
缓慢倒入约650 mL转膜缓冲液。
（10）盖好盖子，接上电源。
根据蛋白分子量来调节工作电流，一般使用100 V（350mA），转移60 - 90 min。
TBSTtaetoweentbe————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：TBST是什么？TBST中含有Tris-Hcl，NaCl，tween20这三种物质，是做WESTERN BLOT 中常用的一种缓冲溶液T ris-B uffered S aline and T ween 20可作为缓冲液，也可作洗涤液（可用TBST洗NC膜）TBST洗涤缓冲液的全称试什么？TB S T是TB S+Tween的缩写，TB S是Tris-HCl缓冲盐溶液，为等渗盐溶液加Tris-HCl缓冲液用1N HCl调pH至7.4，Tween为一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。
用途：Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。
Tris被用于不同pH条件下的蛋白质晶体生长。
Tris缓冲液的低离子强度特点可用于线虫（C. elegans）核纤层蛋白（lamin）的中间纤维的形成。
Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一。
Tris也被用作滴定标准物。
作为蛋白缓冲液时，若后续工作需要质谱，则不适宜用Tris，最好换成其他质谱仪可耐受的缓冲液。
Tris中文别名：三(羟甲基)氨基甲烷;氨丁三醇;缓血酸铵;三羟甲基氨基甲烷;Tris;英文名称： Tris(hydroxymethyl)aminoethane分子式：C4H11NO3Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）TRIS是一种最常用的生物缓冲液，常配成PH值为6.8，7.4，8.0，8.8。
其PH值随温度变化很大。
温度每升高一度，PH值下降0.03,应注意温度对于Tris的pKa的影响。
1M TRIS-HCl 6.8和1.5M TRIS-HCl 8.8是SDS-PAGE最常用的试剂。
而由TRIS配成的TAE，TBE等是DNA电泳最常用的试剂，TE（PH8.0）主要用于溶解DNA。
1、缓冲溶液作用原理和pH值当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变化的作用，称为缓冲作用，这样的溶液叫做缓冲溶液。
弱酸及其盐的混合溶液（如HAc和NaAc），弱碱及其盐的混合溶液（如NH3•H2O和NH4Cl）等都是缓冲溶液。
由弱酸HA及其盐NaA所组成的缓冲溶液对酸的缓冲作用，是由于溶液中存在足够量的碱A-的缘故。
当向这种溶液中加入一定量的强酸时，H+离子基本上被A-离子消耗：所以溶液的pH值几乎不变；当加入一定量强碱时，溶液中存在的弱酸HA消耗OH-离子而阻碍pH的变化。
2、缓冲溶液的缓冲能力在缓冲溶液中加入少量强酸或强碱，其溶液pH值变化不大，但若加入酸，碱的量多时，缓冲溶液就失去了它的缓冲作用。
这说明它的缓冲能力是有一定限度的。
缓冲溶液的缓冲能力和组成缓冲溶液的组分浓度有关。
0.1mol•L-1HAc和0.1mol•L-1NaAc组成的缓冲溶液，比0.01mol•L-1HAc和0.01mol•L-1NaAc的缓冲溶液缓冲能力大。
关于这一点通过计算便可证实。
但缓冲溶液组分的浓度不能太大，否则，不能忽视离子间的作用。
组成缓冲溶液的两组分的比值不为1∶1时，缓冲作用减小，缓冲能力降低，当c（盐）/c（酸）为1∶1时△pH最小，缓冲能力大。
不论对于酸或碱都有较大的缓冲作用。
缓冲溶液的pH值可用下式计算：此时缓冲能力大。
缓冲组分的比值离1∶1愈远，缓冲能力愈小，甚至不能起缓冲作用。
对于任何缓冲体系，存在有效缓冲范围，这个范围大致在pKaφ（或pKbφ）两侧各一个pH单位之内。
弱酸及其盐（弱酸及其共轭碱）体系pH=pKaφ±1弱碱及其盐（弱碱及其共轭酸）体系pOH=pKbφ±1例如HAc的pKaφ为4.76，所以用HAc和NaAc适宜于配制pH为3.76～5.76的缓冲溶液，在这个范围内有较大的缓冲作用。
配制pH=4.76的缓冲溶液时缓冲能力最大，此时（c（HAc）/c（NaAc）=1。
10×TBE缓冲液使用说明10×TBE缓冲液TBE 缓冲液是生物学中常使用的核酸电泳缓冲盐溶液，主要用于DNA 的琼脂糖凝胶电泳。
TBE的主要成分是Tris-硼酸盐与EDTA，缓冲能力强，适合较长时间电泳，分辨率较高，电泳小于1kb的片段时分离效果好。
TBE 缓冲液中的硼酸成分会影响DNA回收效率以及后续的酶反应，若要进行DNA片段的琼脂糖凝胶电泳回收实验，建议使用TAE 缓冲液。
储存条件: 室温储存，有效期至少12个月。
缓冲液其他试剂有：5×TBE 缓冲液10×TBE缓冲液50×TAE 缓冲液D-PBS缓冲液(不含钙镁和酚红)PBS缓冲液干粉1×PBS缓冲液(pH7.2- 7.4)10×PBS缓冲液 (pH7.2- 7.4)柠檬酸钠缓冲液0.01mol/L， pH6.0DNA退火缓冲液（5X）5×蛋白上样缓冲液（含DTT）4×蛋白上样缓冲液（含DTT）2×蛋白上样缓冲液（含β-巯基乙醇）2×蛋白上样缓冲液（含DTT）4×SDS-PAGE分离胶缓冲液(PH=8.8)4×SDS-PAGE浓缩胶缓冲液(PH=6.8)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液10×电泳转移缓冲液（转膜液）Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝胶缓冲液2×Tris-Tricine-SDS-PAGE 上样缓冲液 (含DTT) 柠檬酸钠缓冲液0.1mol/L，pH4.5，无菌溶液1×PBST缓冲液，PH7.2-7.4，0.01M10×PBST20×PBS缓冲液， PH7.2-7.4，工作浓度0.01M pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液pH9.0磷酸盐-生理盐水缓冲液pH9.0碳酸盐-甘油缓冲液基础β-半乳糖酶洗涤缓冲液10× tris-mops缓冲液10×DNA上样缓冲液10×MOPS缓冲液TE缓冲液(PH=8.0)0.5M EDTA(PH8.0)20×TBS1×TBST缓冲液STE缓冲液（PH8.0）1×Tris-tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液（阴极-）10×Tris-tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液（阴极-）10×Tris-tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液（阳极+）1×Tris-tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液（阳极+）10×TBST缓冲液MES 2-(N-吗啡啉)乙磺酸PIPES 1,4-哌嗪二乙磺酸4×非变性蛋白上样缓冲液。
Western-Blot操作流程试剂配制蛋白提取试剂1. RIPA裂解液：50mM Tris（MW121.14，PH7.5） 3.02g150mM NaCl 4.38g1%TritonX-100 5ml1%脱氧胆酸钠5g0.1%SDS 0.5g蒸馏水至500ml。
调pH值至7.5。
混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。
使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。
2. 蛋白酶抑制剂cooktail所需母液成分：（1）100mmol/L PMSFPMSF 17.4mg异丙醇1ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
（2）10mM 亮肽素leupeptin: -20℃保存（3）2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin: 4℃保存配制：成分终浓度每ml裂解液所加母液量PMSF 1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulLeupeptin 0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulAprotinin 1ug/ml （储存浓度稀释2000倍）0.5ul各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。
蛋白定量试剂1. G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250 100mg95％乙醇50ml85％磷酸100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕色瓶中。
2．牛血清白蛋白BSA储存液（1mg/ml）：100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水，定容至100 ml，加少量防腐剂，4℃保存。
上样用试剂1．4X上样缓冲液1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8）2mlSDS 0.8g溴酚蓝0.04g甘油4ml去离子水定容至10ml。
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
使用时稀释成1X。
2．1.0 mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,分装成1ml小份储存于-20?C。
Tel:156****6501E-mail: **************************Website: For Research Use OnlyTBS Buffer, pH7.4 (10×)Cat. No: E-IR-R116Size: 100 mL/ 200 mL/ 500 mL产品编号 产品名称100 mL 200 mL 500 mL Storage E-IR-R116TBS Buffer, pH7.4 (10×)100 mL200 mL500 mL2~8°C产品简介TBS 缓冲液用于Tri-HCl 缓冲盐溶液，为等渗盐溶液加Tri-Hcl 缓冲液。
主要用于免疫组化和原位杂交，酶联免疫、免疫印记实验中清洗非特异性结合的抗体等。
由Tri-HCl 构成稳定的pH 缓冲体系，NaCl 提供等渗条件。
本产品提供的是10× 浓缩液，便于运输。
使用前可稀释成1× 工作液后加入0.1％的Tween 20，增强洗脱能力。
实验操作指南本产品为10× 浓缩液，临用前用去离子水稀释成1× 工作液。
取100 mL 10× TBS 缓冲液，加入去离子水,定容至1 L 即为1× TBS 工作液。
1×TBS 成分145.4 mM NaCl ，10 mM Tirs-base ，pH 7.4。
保存条件2~8°C 保存，保质期12个月。
注意事项1. 若产品出现结晶，请于37°C 进行水浴助溶，待溶解完全后再行稀释使用。
2. 密封保存，防止污染。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
各种PH值的磷酸盐缓冲液配制磷酸盐缓冲液取磷酸二氢钠38.0g，与磷酸氢二钠5.04g,加水使成1000ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH2.0)甲液:取磷酸16.6ml，加水至1000ml，摇匀。
乙液：取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。
取上述甲液72.5ml与乙液27.5ml混合，摇匀，即得。
磷酸盐缓冲液(pH2.5)取磷酸二氢钾100g，加水800ml，用盐酸调节pH至2.5,用水稀释至1000ml。
磷酸盐缓冲液(pH5.0)取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液一定量,用氢氧化钠试液调节pH值至5.0，即得。
磷酸盐缓冲液(pH5.8)取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,加水使溶解成1000ml，即得。
磷酸盐缓冲液(pH6.5)取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2ml，用水稀释至100ml，即得。
磷酸盐缓冲液(pH6.6)取磷酸二氢钠1.74g、磷酸氢二钠2.7g与氯化钠1.7g，加水使溶解成400ml，即得。
磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后,加水稀释至1000ml，即得。
磷酸盐缓冲液(pH6.8)取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.0)取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml，即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.2)取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液50ml与0.2mol/L氢氧化钠溶液35ml，加新沸过的冷水稀释至200ml，摇匀，即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.3)取磷酸氢二钠1.9734g与磷酸二氢钾0.2245g,加水使溶解成1000ml，调节pH值至7. 3，即得。
核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法50×TAE Buffer (pH8.5)组份浓度 2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于1 L烧杯中。
2.搅拌溶解。
3.加入57.1 ml的乙酸，充分搅拌。
4.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。
10×TBE Buffer (pH8.3)组份浓度 890 mM Tris-硼酸，20 mM EDTA配制量 1 L配制方法 l.称量下列试剂，置于l L烧杯中。
2.搅拌溶解。
3.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。
10×MOPS(3-吗啉基丙磺酸)Buffer组份浓度 200 rnM MOPS，20 mM NaOAc，10 mM EDTA配制量 1 L配制方法 1.称41.8 g MOPS，置于1 L烧杯中。
2.加约700 ml DEPC处理水，搅拌溶解。
3.使用2 N NaOH调节pH值至7.0。
4.再向溶液中加入下列试剂。
5.用6.用0.45 m滤膜过滤除去杂质。
7.室温避光保存。
注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。
变黄时也可使用，但变黑时不要使用。
溴乙锭 (10 mg/ml)组份浓度 10 mg/ml溴乙锭配制量 100 ml配制方法 1.称量1 g溴乙锭，加入到100 ml容器中。
2.加入去离子水100 ml，充分搅拌数h完全溶解溴乙锭。
3.将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。
4.溴乙锭的工作浓度为0.5 g/ml。
注意：溴乙锭是一种致癌物质，必须小心操作。
Agarose凝胶配制方法 1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(通常是0.5×TBE或1×TAE)。
2.根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中。
3.加入一定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量)。
注：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。
4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热熔化琼脂糖。
电泳缓冲液（10x）：Tris-Hcl：30.2gGly：187.7gSDS:10g定容至1L,稀释成1x：100ml电泳缓冲液（10x）+900ml单蒸水电转缓冲液1x：Tris-Hcl：3.03gGly：14.4dH2O：900ml100ml：甲醇，定容至1LTBS(10x，1L)Tris-Hcl：12.1gNacl：87.7g调节pH至7.6，用时稀释10倍，加1ml Tween 20，即：TBST=100ml（10x TBS）+900ml dH2O+1ml Tween 20容量为1L5x SDS-page蛋白凝胶上样缓冲液（10ml）1M Tris-Hcl：0.6ml10% SDS：2ml甘油：2.5mlBeta-巯基乙醇：0.5ml溴酚蓝：0.01g(先溶于4.4ml水中)ddH2O:4.4mlWestern blot样品制备以及蛋白质定量1. 取冰，将4°C离心机提前降温。
2. 将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。
3. 弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。
4. 视细胞量的多少加入细胞裂解液。
（1×Cell Lysis Buffer：PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。
PMSF常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。
）5. 冰上裂解30min每隔10min震荡一次，离心：4°C，12000rpm，10min。
或者用超声裂解仪裂解蛋白。
6. 小心将上清转移至新EP管，记下吸取的量。
如：100μL。
7. 将收集好的蛋白保存与—20°C。
（可长期保存）蛋白质定量配置BCA工作液：根据BSA 标准品和待测样品的数量，将试剂A 和试剂B 以50：1 的体积比混匀。
