三氟乙酸在HPLC中的应用

HPLC-ELSD法测定新霉素的有关物质摘要】目的建立HPLC-ELSD法测定新霉素的有关物质的方法。

方法流动相：0.2mol?L-1三氟乙酸溶液-甲醇（98：2）；色谱柱：ODS－HYPERSIL（5μ）125mm×4.6mm，Kromasil-100-5C18：150mm×4.6mm；流速：0.4ml?min-1；雾化管温度：30 ℃；漂移管温度：70 ℃；压力：0.4MPa；进样量：20μL。

结论新霉胺在0.02～0.1mg?mL-1范围内线性良好，线性方程为：y= 1.513x+7.629，r=0.9996 (n = 6)。

HPLC-ELSD法法能够快速、准确测定新霉素的有关物质。

【关键词】新霉素 HPLC-ELSD 有关物质1 溶液的配制供试品溶液的制备精密称取硫酸新霉素样品50.17mg，加水溶解并稀释至50ml，作为供试品溶液。

对照溶液浓度的制备精密称取新霉胺对照品适量，加水溶解依次稀释至浓度为0.04 mg?mL-1，0.05 mg?mL-1，0.06 mg?mL-1，0.07 mg?mL-1，0.08 mg?mL-1的系列对照溶液。

系统适用性溶液的制备分别精密称取新霉胺、巴龙霉素、新霉素B和新霉素C对照品，加水制成约各含0.3mg?mL-1的溶液，摇匀，作为系统适用性试验用溶液。

2 系统适用性试验精密量取系统适用性溶液20μL，在上述色谱条件下分析，各杂质峰的分离度不小于1.5，理论塔板数均大于3000，对称因子均小于1.5。

见图1，2。

3 有关物质测定精密量取标准溶液与供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，按上述方法测定并绘制标准曲线，计算新霉胺的含量为0.1%。

见图3。

4 线性范围的考察精密称取新霉胺对照品适量，分别加水制成含新霉胺0.0201、0.0301、0.0401、0.0502、0.0702、0.1003 mg?mL-1的溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪，以上述测定方法绘制随行标准曲线，得线性方程为：y= 1.513x+7.629，r=0.9996 (n = 6) 。

高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法诊状(一)保留时间变化可能的原因: 解决方法1.柱温变化:柱恒温2.等度与梯度间未能充分平衡:至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够:用>25mmol/L的缓冲液4.柱污染:每天冲洗柱5.柱内条件变化:稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命:采用保护柱(二)保留时间缩短可能的原因: 解决方法1.流速增加:检查泵,重新设定流速2.样品超载:降低样品量3.键合相流失:流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向4.流动相组成变化:防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加:柱恒温(三)保留时间延长可能的原因: 解决方法1.流速下降:管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化:用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.键合相流失:同前(二)34.流动相组成变化:同前(二)45.温度降低:同前(二)5(四)出现肩峰或分叉可能的原因: 解决方法1.样品体积过大:用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强:采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道:更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效:更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏:更换进样器转子(五)鬼峰可能的原因: 解决方法1.进样阀残余峰:每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物:处理样品3.柱未平衡:重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六)基线噪声可能的原因: 解决方法1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声:更换氘灯4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡:流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾可能的原因: 解决方法1.柱超载:降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰:清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4 : 同前(四)45.同前(四)3 5. : 同前(四)36.死体积或柱外体积过大:连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降:用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽可能的原因: 解决方法1.进样体积过大:同(四)12.在进样阀中造成峰扩展:进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢:设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大:设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高:增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大:用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长:等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大:将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载:进小浓度小体积样品液相色谱柱使用及保养液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。

HPLC法测定豆浆中的嘌呤含量毛玉涛;张洪;王明力【摘要】利用HPLC法对豆浆中的嘌呤物质进行检测分析,建立腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤4种嘌呤物质的多组分检测条件并进行方法评价.研究表明:利用Zorbax C18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5.0 μm),流动相以KH2 PO4缓冲液(0.02 mol/L,pH 3.0),在流速1.0 mL/min,柱温25℃,进样量10 pL,检测波长(λ1)为254 nm的条件下,豆浆中的4种嘌呤达到最好分离,其精密度和回收率小于2％.%A feasible method using HPLC which was evaluated for analyzing Adenine,Guanine,Xanthine,Hypoxanthine from soybean milk was established in this paper.The chromatographic conditions were optimized as follows:Zorbax C18 column (4.6 mm ×250 mm,i.d.5.0 μm),254 nm by UV detector with 0.02 mol/L of KH2PO4 buffer solution (pH =3.0) as mobile phase,the flow rate was 1.0 mL/min,the column temperature was 25 ℃,and the sample size was 10 μL.The result showed that several purines can be separated effectively in these conditions with the precision and recovery under 2％.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2015(041)002【总页数】5页(P207-211)【关键词】豆浆;嘌呤;HPLC【作者】毛玉涛;张洪;王明力【作者单位】贵阳市粮油质量检测中心,贵州贵阳,550002;贵州省分析测试研究院,贵州贵阳,550002;贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳,550025【正文语种】中文由RNA、DNA在生命科学研究中的重要地位，可预见到核苷、核碱、核酸及嘌呤物质的分析研究，是生命科学的一个重要领域，解决嘌呤物质的分析问题，在物质检测发展中一直处于核心地位［1］。

HPLC在合成多肽分离与纯化中的应用杜雾晨摘要：固相肽合成（SPPS）技术是目前制备各种模式多肽和天然多肽类似物的最有效方法，但是最终产物的成分往往比较复杂，不经纯化难以用于蛋白质多肽的结构、功能和药理学研究。

近年来已出现了多种多肽及蛋白质的分离纯化技术，高效液相色谱法（HPLC）是目前分析纯化合成多肽的主要手段。

本文根据固相肽合成方法的原理及产物特点，对高效液相色谱法在分析纯化合成肽中的应用作了较为系统的评述。

关键词：固相肽合成；纯化；高效液相色谱法多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。

多肽是构成蛋白质的结构片段,也是蛋白质发挥作用的活性基团,是人体进行代谢、调控活动的重要物质。

蛋白质主要以多肽形式吸收,透过多肽既可深入研究蛋白质的性质,又为改变和合成新的蛋白质提供了基础材料。

研究多肽结构与功能的关系,有助于了解多肽中各氨基酸系列的功效,以便应用中设计尽可能短的多肽同时提高其生理活性,减少临床的不良反应。

多肽类药物在临床上显示了巨大的应用价值,受到药物化学家越来越多的重视,多肽药物的研究和开发成为国际新药技术领域竞争中的重要方面。

化学合成的肽产品是一个纯度不好的粗产品,其一是因为在合成肽过程中各种副反应、消旋化等造成的副反应肽,二是在脱保护过程中,由于保护基的残留,肽键的断裂、烷基化等造成的杂质。

杂质的分子结构与合成肽很相似,或许二者之间仅仅在某一个位置的氨基酸残基不同,或许二者之间的差异仅仅在某一氨基酸残基侧链上某一基团是否存在等等。

由于杂质与合成的肽在分子结构和化学性质上如此相似,就给肽的分离纯化带来了困难[1]。

因此,根据对目的肽的要求,需要选择适当的方法进行纯化。

高效液相色谱(HPLC)是生物技术中分离纯化的重要方法,在多肽、蛋白质的分离纯化工艺中显示出优异的性能。

而且,它已走出实验室投入到大规模的工业化生产中,成为生物技术X围内一有力高效的分离工具[2]。

结论：lowry法与HPLC法所测得的浓度存在一定的差异！
a
6
色谱图比较
25.757
25.688
工作标准品色谱图例
供试品色谱图例
a
7
重复性实验（出峰时间）
批序号
类别 规格（ug/ml） 平均峰出峰时间 RSD值(%)
/
标准品
75
25.546
0.057
/
标准品
150
25.537
0.038
/
标准品
300
实验结论：RSD值﹤2%，符合2015年版《中国药典》要求
a
10
精密度实验（峰面积）
批序号 类别
/ / / 原液批2 成品批4 成品批5 成品批6
标准品 标准品 标准品 供试品 供试品 供试品 供试品
规格 （ug/ml)
75 150 300 300 300 150 75
平均峰面积
RSD值（%）
分析员A 分析员B 分析员A 分析员B
a
4
方法比较（ lowry与HPLC）
Folin-酚（lowry）
要求人为精确控制操作时间 操作复杂，干扰因素较多
重复性、精密度较差 只适用于检测原液的蛋白质含量
HPLC
设备控制时间，减少人为误差 操作简便，干扰因素较少 重复性、精密度较好
适用于原液及成品的蛋白质含量
/
2015年版《中国药典》首次规定的 检测方法
a
5
方法比较（lowry与HPLC）
批序号
原液批1 原液批2 原液批3 原液批4 原液批5 原液批6 原液批7 原液批8
lowry法（ug/ml)
1477 1393 1432 1466 1389 1456 1395 1428

HPLC-CAD法测定硫酸新霉素中新霉素B、新霉素C、新霉胺及其他有关物质刘庄蔚;朱健萍;梁秋霞;蒋洁;杨欣智【摘要】目的建立测定硫酸新霉素中新霉素B、新霉素C、新霉胺及其他有关物质的高效液相色谱-电喷雾检测器(HPLC-CAD)方法.方法采用Waters HSS T3色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),以0.15mol/L三氟乙酸水溶液为流动相,流速1.0mL/min,柱温30℃,电喷雾检测器的雾化温度为45℃.结果新建方法对新霉素B、新霉素C、其他有关物质分离度良好,精密度、重复性和回收率均满足分析要求.新霉素B、新霉胺浓度与峰面积线性关系良好(r＞0.995),检出限可达到0.02μg和0.003μg.结论新建方法分离度好、灵敏度高,可以检出更多的杂质,可以满足硫酸新霉素原料有关物质分析的要求.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2019(044)003【总页数】6页(P370-375)【关键词】电喷雾检测器;硫酸新霉素;有关物质;高效液相色谱法【作者】刘庄蔚;朱健萍;梁秋霞;蒋洁;杨欣智【作者单位】广西壮族自治区食品药品检验所,南宁530021;广西壮族自治区食品药品检验所,南宁530021;广西壮族自治区食品药品检验所,南宁530021;广西壮族自治区食品药品检验所,南宁530021;广西壮族自治区食品药品检验所,南宁530021【正文语种】中文【中图分类】R978.1;R917硫酸新霉素(neomycin sulfate)是首个被发现的氨基糖苷类抗生素，它是1949年Waksman等[1]从新霉素链霉菌代谢产物中分离得到的混合物。

其抗菌谱较广，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、结核杆菌等均有抑制作用[2]，由于新霉素有显著的肾毒性和耳毒性，故常被制备成乳膏剂、软膏剂和滴眼液等外用制剂供患者使用。

据文献报道，硫酸新霉素的主要成分为新霉素A、B、C 3种，新霉素A(新霉胺)仅微量，是新霉素B、C的降解产物之一[1]。

罗汉果甜苷的HPLC法分析
马少妹
【期刊名称】《福建分析测试》
【年(卷),期】2006(015)004
【摘要】目的:为建立全面评价罗汉果的质量的方法.方法:采用超声强化水提取法进行样品前处理,用罗汉果苷Ⅴ作为参照物进行指标成分峰的定位,用HPLC对罗汉果水提取物进行分离,比较了水-甲醇、冰醋酸水溶液-甲醇、磷酸水溶液-甲酸、水-乙睛、磷酸水溶液-乙腈、三氟乙酸水溶液-乙腈6种体系的等度、梯度洗脱效果.结果:实验表明在上述6种流动相体系中,以三氟乙酸水溶液-乙腈的洗脱效果最好,色谱条件:梯度洗脱、Sinochrom ODS-BP柱、检测波长为205nm,流速
0.8ml/min,柱温25℃.结论:采用HPLC技术,可以得到分离度和重现性均较好的罗汉果水提取物的HPLC色谱图.
【总页数】4页(P3-6)
【作者】马少妹
【作者单位】广西民族大学化学与生态工程学院,南宁,530006
【正文语种】中文
【中图分类】O657.72
【相关文献】
1.HPLC-MS法测定罗汉果中6种罗汉果甜苷含量 [J], 牟俊飞;王韶旭;罗琴;王鹏程;黄四新;苏小建;陈旭;梁成钦;周先丽
2.超高压提取罗汉果中罗汉果甜苷V的工艺优化 [J], 王迪
3.HPLC法测定罗汉果中罗汉果苷ⅡE、苷Ⅲ的含量 [J], 李典鹏;黄永林;刘金磊;潘争红
4.利用RP-HPLC法研究罗汉果采后贮藏期甜苷V的含量变化趋势 [J], 梁成钦;周先丽;刘林文;苏小建;徐庆
5.HPLC法测定罗汉果中罗汉果苷V和11-氧化罗汉果苷V [J], 周兢;王梦月;李晓波;屠鹏飞;王强
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HPLC使用注意事项1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。

对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。

5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。

6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。

8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。

清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。

9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。

11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。

12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。

更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状可能的原因解决方法(一)保留时间变化1.柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够用》25mmol/L的缓冲液4.柱污染每天冲洗柱5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命采用保护柱(二)保留时间缩短1.流速增加检查泵,重新设定流速2.样品超载降低样品量3.键合相流失流动相PH值保持在3"7.5检查柱的方向4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加柱恒温(三)保留时间延长1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化3.键合相流失同前(二)34.流动相组成变化同前(二)45.温度降低同前(二)5(四) 出现肩峰或分*1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏更换进样器转子(五)鬼峰1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物处理样品3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六) 基线噪声1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声更换氘灯4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4 同前(四)45.同前(四)3 5.同前(四)36.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽1.进样体积过大同(四)12.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载进小浓度小体积样品。

高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸残留【摘要】目的建立高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸的残留含量。

方法色谱柱：采用Hypersil ODS柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长210 nm，流动相：0.08%磷酸溶液（Ph 3.0）-甲醇（95：5），流速1.0 ml/min，柱温：35℃。

结果三氟乙酸浓度在 2.05～12.12 μg/ml范围内，线性关系良好，r=0.9998；检测限为1.0 ng；加样回收率平均为98.57%，RSD 为0. 99%。

结论此法可用于塞来昔布中三氟乙酸含量的测定，准确度高。

【关键词】塞来昔布；高效液相色谱法；三氟乙酸；含量测定塞来昔布（4-[5-（4-甲基苯基）-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺）是第一个在骨关节炎和风湿病的治疗中起作用的COX-2抑制剂[1，2]。

这个药与传统的非类固醇性抗炎剂联用时无通常的副作用。

GD Searle研发出了塞来昔布，目前市场上商品名为西乐葆。

在塞来昔布的合成工艺中，一般以对甲基苯乙酮和三氟乙酸乙酯经Claisen 缩合反应制得中间体，然后与对苯磺酰胺基苯肼盐酸盐化合制得塞来昔布。

由于三氟乙酸乙酯会水解生产三氟乙酸，因此在塞来昔布原料药的质量标准中，对三氟乙酸限量有明确要求，进口注册标准中规定三氟乙酸不得超过0.04%。

本实验建立了高效液相色谱法（HPLC）测定塞来昔布中三氟乙酸残留的方法。

1 材料塞来昔布，江苏正大清江制药有限公司提供，批号：20121029、20121103、20121109、20121118；三氟乙酸对照品（色谱纯），美国天地试剂有限公司；甲醇（色谱纯），江苏汉邦科技有限公司；其余试剂均为市售分析纯。

美国Waters Alliance 2695 高效液相色谱仪，2487紫外可变波长检测器，Empower 2色谱工作站。

2 方法与结果2. 1 色谱条件色谱柱：Hypersil ODS 柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：0.08% 磷酸溶液（pH3.0）- 甲醇（95：5）；流速：0.8 ml/min；检测波长：210 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μl。

三氟乙酸酐过氧化脲拜尔氧化概述说明1. 引言1.1 概述在有机合成领域中，三氟乙酸酐是一种常用的强酸和酰化试剂，广泛应用于卤代烷烃的酰基化反应、羧酸的脱水反应和有机合成中的其他重要转化。

同时，过氧化脲拜尔氧化作为一种常见的氧化剂，具有高效、可控性好、环境友好等优点，并且在有机合成中扮演着重要角色。

本文通过概述三氟乙酸酐和过氧化脲拜尔氧化两个方面的相关知识，旨在展示它们在实验研究和工业生产上的应用前景。

1.2 文章结构本文将按照以下结构进行描述和分析：首先介绍三氟乙酸酐，包括其定义与性质以及制备方法；其次详细阐述过氧化脲拜尔氧化的反应机理、实验条件与参数影响以及其在合成策略与应用前景方面的相关内容；接下来进行实验研究与案例分析，主要包括对反应条件与实验结果的分析、案例分析及比较研究以及实验数据处理与解释；最后总结本次研究工作，并对存在问题和不足进行评估，同时探索未来进一步的研究方向。

1.3 目的本文的目的是全面概述三氟乙酸酐和过氧化脲拜尔氧化两个方面的知识，并通过实验研究与案例分析展示它们在化学领域中的应用。

希望通过本文的阐述，读者对于三氟乙酸酐和过氧化脲拜尔氧化有更深入的理解，并为未来相关研究提供参考和启发。

2. 三氟乙酸酐2.1 定义与性质三氟乙酸酐，化学式为(CF3CO)2O，是一种常见的有机化合物。

它是一个无色液体，在常温下具有强烈的刺激性气味。

三氟乙酸酐具有较高的反应活性和化学稳定性，在许多有机合成反应中被广泛使用。

2.2 制备方法三氟乙酸酐可以通过多种方法制备。

其中一种常用的方法是将氯代乙酸（ClCH2COOH）与过量的三氟化铝（AlF3）在低温下反应得到。

2.3 应用领域由于其较高的反应活性和化学稳定性，三氟乙酸酐在有机合成中具有广泛的应用。

它可以作为强力的取代试剂，可与碱、醇、胺等底物发生反应，生成相应的烷基、烷基芳基等取代产物。

此外，三氟乙酸酐也可用于合成含有羧基或羰基化合物，并可参与多种环化、缩合和重排反应。

第16卷第2期2010年06月分析测试技术与仪器ANALYS IS AND TEST I NG T EC HNOLOGY AND I N S TRUM ENTSV o l ume16N u mber2June2010专论(71~77)高效液相色谱柱清洗与再生方法刘 翻,熊志超,张凌怡,张维冰(华东理工大学化学与分子工程学院,上海 200237)摘 要:分别对反相、正相、离子交换、体积排阻及亲和等色谱柱的清洗与再生方法加以系统综述.使用适当的方法对受污染的色谱柱进行清洗与再生,可恢复其部分分离能力,延长使用寿命.对硅胶基质反相色谱柱,可选择一系列溶剂,按洗脱能力逐渐增强的顺序依次冲洗,或者使用二甲基甲酰胺、乙酰丙酮、S D S及盐酸胍等强洗脱试剂清洗;硅胶基质正相色谱柱用极性逐渐增强的溶剂系统冲洗;有机聚合物、石墨碳及氧化锆固定相色谱柱,用稀酸、稀碱和有机溶剂结合清洗,可将受污染的色谱柱柱效提高50%以上.关键词:高效液相色谱;色谱柱;清洗;再生中图分类号:O657.32文献标识码:A文章编号:1006 3757(2010)02 0071 07色谱作为一种高效的分离手段,自1906年Ts w ett创立至今百余年来得到了长足发展.高效液相色谱(H PLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种色谱方法,已成为现代分离测定的重要手段,广泛运用于石油、化工、食品科学、环境及生物等几乎所有研究领域[1].色谱柱是色谱分离系统的"心脏",由于被分析样品种类繁多,加之样品基质复杂,色谱柱极易被污染,是导致柱压升高、分离能力下降的原因之一[2].通常,样品中含有一些对分析不利的物质,这些非目标物能被检测器检测到而形成色谱峰、气泡、基线漂移或负峰.其中保留值较弱的物质,一般能快速从色谱柱冲洗出来,对分析不产生干扰.中等保留强度的杂质能被缓慢冲洗出来,但对分析产生一定的干扰.强保留杂质通常难以被洗脱,多次上样后,聚集在柱头或色谱柱中.有的分析物甚至可能在使用时与填料发生相互作用.这些被吸附的杂质累积到一定程度后会形成新的伪固定相,从而改变色谱柱的性能.对于基质复杂的样品,一根色谱柱的使用寿命可能只有百余次.而且每种色谱柱适用的样品有限,一次错误进样甚至可能导致色谱柱失效.中国市场调查研究中心在中国反相色谱柱市场调查及投资策略分析报告中估计,中国每年消耗的分析型反相色谱柱达5万支[3].这些被污染的色谱柱有一部分经简单的方法进行清洗后,可恢复部分甚至大部分离能力,不仅节省资源,还能大大降低分离分析的成本.色谱柱的清洗与再生方面的研究具有十分重要的现实意义,也一直是色谱工作者和仪器厂商关注的热点.很多色谱专著介绍过色谱柱清洗与再生,并提出许多简单有效的方法,各色谱柱厂商也推荐对应其商品色谱柱的经验性方法.本文对液相色谱柱清洗和再生方法加以系统综述,并在此基础上对各种色谱柱的清洗和再生提出建议.1 反相色谱柱的清洗和再生反相色谱法是当今液相色谱法中应用最广泛的一种技术,它能分析非极性、可离子化和离子化样品,应用比例超过90%.随着HPLC技术的发展,色谱柱的种类也越来越多,除经典的键合硅胶固定相填充柱,还有如聚合物填充柱、聚合物整体柱及以氧化锆基质固定相为代表的其它无机基质固定相色谱柱.这些色谱柱因其固定相基质差异,具有不同的物收稿日期:2010-01-25; 修订日期:2010-03-25.基金项目:国家自然科学基金资助项目(20675083);国家重点基础研究发展规划(973)资助项目(o1CB5m202);科技部 十一五国家科技支撑计划重大项目资助(2006BAF07B03).作者简介:刘翻(1983-),男,博士研究生,主要从事色谱研究工作.通讯联系人:张维冰,教授.E-m a i:l w e i bi ngzhang@理和化学性质及应用范围,其清洗与再生方式也存在一定差别.1.1 硅胶基质反相色谱柱的清洗与再生在反相色谱中,硅胶基质色谱柱使用比例达70%,被应用于各种样品的分析.清洗硅胶基质反相色谱柱,关键是弄清楚污染物的性质,并且能找到合适的溶剂将其洗脱.对于被不同样品污染的色谱柱,如常规样品污染、蛋白质污染及金属离子污染的色谱柱,具有对应的清洗和再生方法.1.1.1 常规样品污染色谱柱清洗与再生方法被常规样品污染的硅胶基质反相色谱柱,已有各种清洗与再生方法.其中最常用的是用20倍柱体积(这里柱体积指色谱柱内空腔体积,表1列出了常用规格分析柱柱体积[4])的乙腈!二氯甲烷!正己烷!二氯甲烷!乙腈冲洗色谱柱[5],或者用强度更弱的溶剂系统清洗,即:水!乙腈!氯仿(或异丙醇)!乙腈!水冲洗,其中水冲洗步骤可以省略[6].艾杰尔公司使用乙腈∀水(5∀95,V/V)!四氢呋喃!乙腈∀水(5∀95,V/V)冲洗10倍柱体积,此方法达到较为理想的结果,同时能大大节省时间.强酸和强碱溶液会导致硅胶基质填料溶解,但是在某些条件下使用稀酸可以将有机溶剂不能洗脱的污染物去除,如用甲醇!氯仿!甲醇冲洗20倍柱体积达不到清洗效果,可依次用20倍柱体积水、0.05m o l/L的硫酸和流动相溶液冲洗色谱柱,可取得良好效果.经过多次进样的色谱柱,用90%~100%的溶剂B(强洗脱溶剂)冲洗20倍体积即可清除污染物[7-9].当强洗脱溶剂无法洗脱时,则有必要用更强的一种或一系列溶剂清洗,即:100%甲醇!100%乙腈!乙腈∀异丙醇(75∀25,V/V)!100%异丙醇!100%二氯甲烷或100%正己烷.根据色谱柱具体使用情况,在清洗过程中可省略一个或多个有机溶剂[4].表1 不同柱长的H PLC色谱柱柱内死体积Table1 Colu m n volu m es of analytical col umn s柱尺寸/mm 柱内死体积/mL柱尺寸/mm柱内死体积/mL4.6#2502.54.6#1001.04.6#2002.04.6#500.54.6#1501.5除了以上这些方法之外,还有一些使用更强溶剂、耗费时间较短的方法.依利特公司用20倍柱体积的二氯甲烷∀甲醇(96∀4,V/V),加1%氢氧化铵冲洗,其中加入的氢氧化铵对聚集在柱头的污染物具有良好的清洗效果.二氯甲砜也被The m o公司用于色谱柱的清洗,具体方法是:在用水冲洗色谱柱同时进4等份的200 L二氯甲砜,然后依次用甲醇、氯仿和甲醇冲洗.用N,N-二甲基甲酰胺、丙酮依次冲洗色谱柱,可将色谱柱柱效提高约50%[10].这些方法耗时短,但使用的特殊溶剂,如氢氧化铵、二氯甲砜、N,N-二甲基甲酰胺等,均对色谱固定相有一定损伤.当色谱柱被严重污染,可在低于0.5mL/m i n的流速下用二甲基亚砜(D M SO)或50%二甲基甲酰胺-水冲洗色谱柱[4].实验证明在线清洗与再生的方法对非严重污染色谱柱非常有效,对污染特别严重的色谱柱不能达到理想效果,需将固定相从色谱柱内取出,进行清洗再生后重新装填.具体操作是:将色谱固定相从色谱柱内打出后,用甲醇浮选,去除其中细小的破碎颗粒;然后用二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇超声清洗;最后70∃水浴蒸干固定相,重新装填色谱柱.经该方法处理的色谱柱,性能可得到显著提高[10].由上述方法可以看出,一般清洗方法所用的溶剂系统,溶剂洗脱强度均逐渐增加,使用强疏水性溶剂(如氯仿和正己烷)溶解非极性物质如类脂和油类,这类物质往往是色谱柱污染的最主要原因.正如正相与反相系统替换时,必须使用过渡溶剂冲洗系统,在色谱柱清洗与再生过程中,也必须保证一系列溶剂中每种溶剂都均与下一个溶剂互混.异丙醇能与正己烷或二氯甲烷互溶,又与水相溶剂互溶,常在清洗过程中用作过渡溶剂.但是异丙醇粘度非常大,需使用较低的流速以免导致泵压过高.而使用过渡溶剂,清洗步骤繁琐,正如M ajors所说:这是一个繁杂而又非常耗时的过程[4].此时利用梯度系统进行过夜操作是最好的选择,但梯度操作的系统要求更高,对一个复杂的清洗方法往往需要四元甚至五元梯度系统.1.1.2 金属离子污染色谱柱的清洗当色谱柱被金属离子污染后,一般的清洗方法无法生效,需使用特殊的清洗方法.磷酸和0.1m ol/L柠檬酸对色谱柱上吸附的金属离子具有较好的清洗效果,因此常被人们用来清洗被金属离子污染的色谱柱[7].乙二胺四乙酸(EDTA)能同许多金属离子形成配合物,0.05m o l/L的EDTA水溶第2期刘翻,等:高效液相色谱柱清洗与再生方法液也可用来去除色谱柱中金属离子污染物[4].这些试剂虽然能去除金属污染物,但也存在一些缺陷,如水溶液对固定相的浸润性较差,清洗效果不太理想;磷酸对固定相上键合相有一定的破坏作用;EDTA 带入钠离子,对固定相性能产生影响.以乙酰丙酮-甲醇冲洗色谱柱,可以有效去除金属离子污染物,同时可避免上述不利影响.该方法操作步骤是:将固定相用乙酰丙酮超声清洗1~3m i n,然后以甲醇萃取出乙酰丙酮[10].对于键合色谱固定相,如果确认了填料表面官能团配基断裂流失,可将合适的硅烷化试剂通入色谱柱,在一定温度下使之与表面暴露的-OH活性基团反应,使硅烷分子中的烷基重新键合在失效的填料颗粒表面.这种原位重新键合的再生方法仅能恢复部分柱效,且对5 m填料再生后柱压力容易偏高[11].1.1.3 蛋白质污染色谱柱的清洗随着蛋白质组学的发展,反相色谱柱也被广泛运用于蛋白质和多肽的分离,蛋白质对反相色谱柱的污染已成为常见问题.蛋白质分子量大,同时具有亲水和疏水特性,对很多物理和化学因素敏感.一般情况下,纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能很好溶解多肽和蛋白质,不能有效地清洗色谱柱,因而需要一些特殊的清洗方法.现常用方法是用不含缓冲盐的流动相!0.1% TFA(三氟乙酸)水溶液!乙腈∀异丙醇(1∀2,V/V,含0.1%TFA)!流动相冲洗20倍柱体积[12].或先用去除缓冲盐的流动相运行一个梯度洗脱程序(A: 0.1%的三氟乙酸水溶液;B:乙腈∀异丙醇=1∀2, V/V,内含0.1%三氟乙酸,30m i n内B由25%到100%);然后用0.1%稀硝酸∀异丙醇(1∀4,V/V)冲洗40倍柱体积,最后用10倍柱体积的水∀异丙醇(1∀4,V/V)冲洗色谱柱[13].当上述方法无效时,可使用一些苛刻的试剂,如盐酸胍、二甲基甲酰胺及表面活性剂等.如用50%异丙醇水溶液冲洗时,将6 m o l/L盐酸胍水溶液与异丙醇按1:l混合,进样250 L;或者用30%二甲基甲酰胺水溶液清洗,时间不超过30m i n,处理后反复用水、甲醇冲洗.在常规流动相冲洗色谱柱时注射500 L的1%十二烷基硫酸钠(SDS),然后用5%~95%乙腈/水(含0.1% TFA)梯度冲洗,去除蛋白污染物效果也较好[14]. W aters公司研究发现,反复注射200 L二甲亚砜可以有效去除蛋白类物质.甚至在一些特殊的情况下,若已确定蛋白质污染物种类,可将对应蛋白水解酶(如1%胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)注入色谱柱,将蛋白质水解为肽,再用盐溶液洗脱.当确定色谱柱被蛋白质污染后,应首先尝试用含高比例强溶剂的流动相进行冲洗(溶剂B),或重复用三氟乙酸水溶液-三氟乙酸丙醇溶液的上升-下降梯度清洗和注射三氟乙酸清洗.如这些方法不能得到理想结果,可用表2中的溶剂从上往下进行冲洗(根据具体情况,可以省略其中几步).其中尿素和胍是为洗脱非特异性吸附的蛋白[14],使用后至少需用40-50倍柱体积的水冲洗色谱柱[4].表2 蛋白污染反相色谱柱常用清洗溶剂组成Tab le2 W ashing solvents for re m oving prote i naceous m ater i a l fro m HPLC reversed-phase co l umn s清洗溶剂溶剂配比乙酸1%水溶液三氟乙酸(T FA)1%水溶液0.1%T FA∀异丙醇40∀60(V/V)(黏度较大,需调整流速)三乙胺(TEA)∀异丙醇40∀60(V/V)(混合前用磷酸将三乙胺调至p H=2.5)尿素或胍水溶液5~8m o l/L(调节p H=6~8)氯化钠、磷酸钠或硫酸钠水溶液0.5~1.0m ol/L二甲亚砜(DM S O)∀水或二甲基甲酰胺∀水50∀50(V/V)总之,被污染的硅胶基质色谱柱,应根据污染物类型和污染程度选择合适的清洗与再生方法.被常规样品污染的反相硅胶键合色谱柱,现有常规清洗与再生方式大致相同,从极性溶剂清洗至非极性溶剂,然后恢复至极性溶剂状态.这些方法,一方面耗时长,另一方消耗溶剂量大,同时再生效果不一定好.使用一些特殊的强溶剂清洗,又对色谱柱填料造成损害.因此,清洗与再生色谱柱时应根据实际情况而定,对污染程度较轻的,用甲醇!二氯甲烷!甲醇分别冲洗20倍柱体积;污染较严重的色谱柱,使用甲醇!二氯甲烷!甲醇!0.05m o l/L硫酸各冲洗20倍柱体积,或者用甲醇!50%二甲基甲酰胺水溶液!丙酮!甲醇分别冲洗10倍柱体积,能取得较好效果同时耗费时间较短.对严重污染的色谱柱,可先依次用二甲基甲酰胺、丙酮、乙酰丙酮、甲醇冲洗20倍柱体积.如效果不理想,可将色谱填料从色谱柱中73分析测试技术与仪器第16卷取出,然后用甲醇浮选,去除填料中细小破碎颗粒;再用二甲基甲酰胺!丙酮!乙酰丙酮!甲醇超声清洗;最后重新装填.同时该方法还可去除金属离子污染物.蛋白质污染色谱柱,不论是用高浓度的磷酸盐溶液,还是用尿素或胍来清洗色谱柱,对色谱柱都会产生较大损伤,同时损害色谱仪器.使用注射1% SDS法清洗色谱柱,不仅节省时间,还能得到较好的效果,是现有清洗方法中较优的选择.1.2 有机高分子类反相色谱柱的清洗与再生有机高分子色谱柱,如其中最普通的聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)颗粒或整体材料装填的色谱柱,可在很宽的pH范围内使用(通常为p H= 1~13,有的可达p H=0~14),在反相色谱中被广泛应用,特别是生物样品分析[15].对被普通生物样品污染的有机高分子类反相色谱柱,The m o、依利特及艾杰尔等厂商推荐用1.0m ol/L的硝酸或氢氧化钠清洗.被难溶性蛋白(如膜蛋白、结构蛋白和病毒膜蛋白)污染的有机高分子色谱柱,需要苛刻的清洗条件,如用含3m o l/L盐酸胍的50%异丙醇水溶液在60∃下冲洗,或者依次用3~5倍柱体积100%的异丙醇、二氯甲烷、异丙醇、原始流动相冲洗,可取得良好效果[4].在淋洗液中添加浓度为6~ 8m ol/L的尿素或0.2%~0.3%的表面活性剂冲洗色谱柱,可去除其中强保留生物污染物.用0.5~ 1 0m o l/L氢氧化钠水溶液在室温下冲洗1h以上,可使色谱柱中微生物失活或将其洗脱.根据聚合物上键合的功能团不同,使用不同的清洗方法效果更佳(Shodex公司):没有键合功能团的有机高分子色谱柱用50m L二氧六环!乙腈或甲醇冲洗,或用含有0.1%TFA的异丙醇!100%流动相B!100%流动相A以一半工作流速冲洗5~10倍柱体积;键合磺酸基的有机高分子色谱柱,可用50mL乙腈和50mm o l/L氢氧化钠冲洗,或者注射20~50 L的0.5m o l/L氢氧化钠或2m o l/L硝酸清洗;键合苯基的有机高分子疏水性色谱柱,用洗脱溶剂在0.5mL/m in流速下反冲,并注射几次1~2 mL的0.1m ol/L氢氧化钠或30%硝酸;含丁基或乙基的甲基丙烯酸脂整体柱,可以在反流向情况下分别用10倍柱体积的1.0m o l/L氢氧化钠!水! 20%乙醇!工作缓冲液冲洗.应注意,虽然高交联聚合物具有好的机械稳定性,在水及有机溶剂中只发生极小的溶胀,在某些特殊的溶剂中其会溶解或发生大的收缩或膨胀,在使用一系列有机溶剂清洗聚合物柱前,最好先查阅说明书或咨询厂家.一般来说,受污染的有机高分子反相色谱柱可用50mL乙腈反冲,并辅以注射几次20~50 L1m o l/L氢氧化钠溶液或硝酸清洗.对强保留的蛋白质污染物,使用50%异丙醇并注射少量SDS清洗,然后用甲醇冲洗,可得到较好结果.1.3 石墨化碳和金属氧化物基质填料色谱柱清洗与再生氧化锆较硅胶惰性更强,涂敷了氧化锆的色谱填料,能够经受住苛刻的操作环境,如高的p H值和操作温度.由于其特殊的表面特性,碳酸、氟化物、磷酸根等离子会强烈地吸附于氧化锆色谱填料上.为将它们从色谱柱中清除,可以用酸、碱和有机溶剂结合清洗:50倍柱体积的20%乙腈!0.1m o l/L氢氧化钠水溶液或0.1m ol/L四甲基氢氧化铵水溶液! 10倍柱体积水!10倍柱体积的20%乙睛-0.1m o l/L硝酸!10倍柱体积水!20倍柱体积有机溶剂依次冲洗(Z ir Chr om公司).石墨化碳也被用作反相色谱柱填料,这种填料的性质不同于硅胶基质烷基键合相,其表面即是保留的基础,不再需其它表面改性.该类填料一般比烷基键合硅胶及多孔聚合物填料保留能力更强,常用于分析强亲水性物质.对受污染的石墨化碳色谱柱,在聚合物色谱柱清洗溶剂中加入20%的四氢呋喃,即可达到清洗与再生目的[4].不同的分析样品中具有不同的污染物,而这些污染在色谱柱上保留行为也不一致,对被分析不同样品的色谱柱,使用对应的清洗与再生方法具有更佳的效果.根据The m o公司介绍,对于分析不同样品的受污染石墨化碳反相色谱柱以下方法分别进行清洗,可显著提高被污染色谱柱的柱效:(1)离子类分析物:酸碱再生.将色谱柱反接,依次用50mL含0.1%三氟乙酸的四氢呋喃∀水(1∀1,V/V)溶液、含0.1%三乙胺或氢氧化钠的四氢呋喃∀水(1∀1,V/V)溶液、含0.1%三氟乙酸的四氢呋喃∀水(1∀1,V/V)溶液冲冼,然后用70倍柱体积的四氢呋喃冲洗,最后用95%甲醇水溶液重新平衡.(2)极性或离子型分析物:强有机溶剂再生.依次以50mL丙酮、120mL二丁醚、50mL丙酮冲洗色谱柱,最后用流动相平衡.(3)三氟乙酸的去除:用70倍柱体积四氢呋喃冲洗.74第2期刘翻,等:高效液相色谱柱清洗与再生方法(4)二乙胺的去除:用乙腈在75∃下冲洗120倍柱体积.2 正相色谱柱的清洗与再生通常正相色谱柱的清洗与再生方法与反相色谱柱用极性逐渐减弱的溶剂系统冲洗相反,其用极性逐渐增强的溶剂系统冲洗[16].根据The m o公司研究,硅胶、氧化铝、极性键合相色谱柱按以下方法冲洗:3-甲基戊烷或己烷!三氯乙烷!乙酸乙脂!丙酮!乙醇!水,然后以这些溶剂逆序冲洗,最后以流动相平衡.该方法从非极性溶剂缓慢过渡至极性溶剂水,然后逆序冲洗至非极性溶剂,对色谱柱损伤小,且具有良好的再生效果.然而该方法耗时长,消耗溶剂多,在很多时候应用较少,因此在具体应用过程中可省略其中一种或几种溶剂.Ag ilent公司使用的方法更简洁,用甲醇∀氯仿(50∀50,V/V)!乙酸乙酯反冲色谱柱,然后再按正方向用流动相平衡.常规硅胶或硅胶基质正相色谱柱,也可依次以四氢呋喃、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷和无苯正己烷冲洗40 ~60倍柱体积[15],或用5%~95%乙腈水溶液的60 m in梯度清洗,然后用30mL含2.5%二甲氧基丙烷和2.5%冰醋酸的正己烷溶液冲洗色谱柱,除去硅胶上吸附的水(艾杰尔公司).对强惰性的石墨化碳和有机聚合物正相柱,可以使用一些强酸或强碱清洗.Shodex及The m o公司用的稀酸和稀碱结合清洗法,可将有机聚合物正相柱上大部分污染物洗脱:5mL水!60mL的0 1 m o l/LH C l O4水溶液!5mL水!60m L的0.1mo l/L N a OH水溶液!5mL H2O在0.5mL/m i n流速下反向冲洗.使用0.1m o l/L盐酸与有机溶剂结合清洗石墨化碳柱,也具有良好的再生效果:二氯甲烷、甲醇、水、0.1mo l/L盐酸、水、甲醇、二氯甲烷,最后用流动相冲冼至平衡.3 离子交换色谱柱的清洗与再生离子交换色谱柱在极端pH范围和高盐浓度条件下长时间使用,或者分析蛋白等生物类样品后,盐离子及蛋白质会吸附于固定相表面,导致色谱柱分离能力下降,柱压升高,峰形变差.常用离子交换色谱柱的清洗与再生一般首先用纯水除去柱中盐,然后以有机溶剂(如甲醇)除去基于分配作用吸附在填料上的杂质,再用纯水冲洗色谱柱;或者用0.1m o l/L柠檬酸洗涤,然后用水洗去柠檬酸[4].阴、阳离子交换色谱柱性质存在一定差异,使用不同清洗方法可能会取得更好效果.如阴离子交换柱用水、3%的H2BO3或N a OH(非硅胶基质)冲洗,阳离子交换柱用水和酸冲洗.依利特及The m o公司均推荐用水!甲醇!氯仿冲洗阴离子交换色谱柱;阳离子交换色谱首先以水冲洗,并在冲洗过程中注射4等份200 L二甲基亚砜,再用四氢呋喃冲洗.硅胶基质离子交换色谱柱,限于硅胶的性质不能使用强酸或强碱清洗,树脂离子交换色谱柱则无此限制.对树脂离子交换色谱柱,高浓度的盐溶液(1~2m o l/L的N a C l溶液)即可恢复其大部分分离能力,油脂等少数与树脂紧密结合的物质可用低浓度酸或碱溶液(如0.1~0.2m o l/L的N a OH水溶液,20%~40%乙酸水溶液)冲洗除去.硅胶柱可用一定程序的水溶液清洗,亦可达到再生的目的: 0.5~1.0m ol/L的盐缓冲溶液!pH为2~3的缓冲溶液!添加水溶性有机溶剂(如10%~20%浓度的甲醇、乙腈、乙醇等)的缓冲溶液!添加8m o l/L尿素或非离子型表面活性剂的缓冲溶液[17].对于分析生物样品的离子交换色谱柱,可以使用一些特殊的方法进行清洗和再生.四氢呋喃-乙腈或甲醇冲洗可去除脂类;乙腈!丙醇!1%三氯乙酸进行梯度冲洗可去除蛋白质;在乙腈或甲醇冲洗同时反复注入四氢呋喃(100~200 L)可去除某些高疏水性化合物[18].通常吸附在固定相表面的酸性有机物用低p H缓冲液冲洗,碱性有机物用高p H缓冲液冲洗,然后依次用蒸馏水、甲醇、二氯甲烷、甲醇、水冲洗[16].离子交换柱中强吸附的蛋白质可使用蛋白酶去除:将2%的酶溶液700~800 L用高压泵注入色谱柱中,37∃反应24h,再先后用0.025 m ol/L磷酸盐缓冲溶液(p H7.1)和含0.5m o l/L NaC l的0.025m o l/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.1,流量0.5m L/m in)进行充分淋洗.该方法对已知被蛋白质污染十分严重的色谱柱,能取得非常好的效果,且重复性良好[18].对受污染的离子交换色谱柱,可根据色谱柱性质及具体污染情况,选择强酸性或强碱性溶液、高盐溶液、含有机溶剂的缓冲溶液、含尿素等溶剂或表面活性剂(非离子型表面活性剂)的缓冲溶液、某些蛋白质变性剂(如盐酸胍和尿素等)以及蛋白酶中一种或几种组合进行清洗和再生.4 体积排阻色谱柱的清洗与再生体积排阻色谱是基于分子尺寸大小将物质分离75的一种色谱模式,其使用的色谱固定相包括有机凝胶和无机凝胶固定相两大类.硅胶凝胶色谱柱在酸性条件下官能团会发生脱落,碱性条件下硅胶基质会发生溶解,故清洗时注意清洗液p H值,以免损坏色谱柱.有机聚合物凝胶柱耐受p H范围宽,可以用较极端p H的清洗液进行清洗:用稀氢氧化钠或非离子型去垢剂去除大部分的结合物质,如果污染物是一些难洗脱的蛋白质,则需要使用特殊清洗方法,用90%的乙醇、30%的乙腈或30%异丙醇在低流速下冲洗过夜除去疏水蛋白质.对亲水性蛋白质和肽,可用提取液、去污剂或1m ol/L乙酸低流速冲洗色谱柱过夜,甚至可将溶于0.1m o l/L乙酸和0.5 m o l/L N a C l中的1m g/mL胃蛋白酶注入色谱柱,在37∃孵育1h,再用平衡液冲洗色谱柱除去亲水蛋白质,然后以蛋白水解酶处理分解凝胶中剩余的痕量胃蛋白酶,再用水!甲醇!水冲洗[17,19].清洗与再生体积排阻色谱柱过程中,流速需低于50%最大推荐流速,每种溶液冲洗10~15倍柱体积即可,更换清洗溶剂时需用3~5倍柱体积去离子水将色谱柱冲洗干净.通常体积排阻色谱柱上离子性吸附的碱性杂质可用高浓度中性盐溶液(如0 5m o l/L硫酸钠溶液)去除;含有机溶剂(如10~ 20%的甲醇、乙腈、乙醇等)的缓冲溶液(如50 mmo l/L磷酸盐缓冲液,pH=7.0)可洗脱吸附的疏水性杂质;吸附最强的杂质,可在清洗溶剂中添加尿素、中性表面活性剂(6~8m o l/L的尿素或0.2~ 0 3%的中性表面活性剂)进行洗脱[20-21].5 其他色谱柱的清洗与再生高效液相色谱测定糖醇等物质的含量时,使用特殊的糖醇色谱柱,其价格及其昂贵.对受污染的糖醇色谱柱用0.2m ol/L硝酸钙溶液作为流动相,在85∃下,流速为0.2mL/m i n,反相冲洗色谱柱24h,然后在相同条件下用10~20倍柱体积水冲洗,可取得较好的再生效果,延长色谱柱使用寿命,降低分析成本[22].基于特异性吸附作用将物质分离的亲和色谱柱和手性色谱柱,可依据具体色谱柱的特性,选择合适的强洗脱液,在0.5mL/m i n流速下反向冲洗色谱柱.其它如亲水作用色谱柱和疏水作用色谱柱,根据其使用条件,参照对应色谱模式选择合适清洗与再生方法[23-24].6 结论被污染的色谱柱,根据其具体情况,应选择合适的清洗与再生方法进行清洗,一般可将其柱效提高50%以上.对硅胶基质反相柱,污染情况较轻时可选择一系列溶剂,按洗脱能力逐渐增强的顺序依次冲洗,如甲醇!二氯甲烷!甲醇!0.05m ol/L硫酸各冲洗20倍柱体积;当其被严重污染时,可依次用二甲基甲酰胺、丙酮、乙酰丙酮、甲醇冲洗20倍柱体积,或将色谱固定相从色谱柱中取出,用二甲基甲酰胺!丙酮!乙酰丙酮!甲醇超声清洗;被强吸附蛋白质污染,使用注射1%SDS法清洗,能得到较好的效果.硅胶基质正相色谱柱用极性逐渐增强的溶剂系统冲洗;有机聚合物、石墨化碳及氧化锆固定相色谱柱(正相或反相均可),用稀酸、稀碱和有机溶剂结合清洗.离子交换色谱柱和体积排阻色谱柱可用高浓度中性盐溶液、含有机溶剂的缓冲溶液及加有尿素、中性表面活性剂的缓冲液进行洗脱;严重污染时可使用强酸性或强碱性溶液(非硅胶基质色谱柱)、蛋白质变性剂以及蛋白酶进行清洗和再生.随着H PLC的发展,新型色谱柱层出不穷,用于分析特殊样品的专用色谱柱被大量应用与生产生活之中.鉴于现有色谱柱清洗与再生方法的局限性和繁杂性、各种专用色谱柱价格昂贵以及新型色谱柱多样性,预计未来色谱柱的清洗与再生方面研究在以下方面会成为热点:%开发使用溶剂少,较现有方法更简单有效的色谱柱清洗与再生方法;&针对各种专用色谱柱的清洗与再生方法;∋适用于新型及CEC等其它类型色谱柱的清洗与再生方法.参考文献:[1] 孙元社,李彤,张玉奎.色谱技术的现状及与人们日常生活的关系[J].科学仪器仪表,2007,9:69-73. [2] Snyde r L R,K irkland J J,G lajch J L.实用高效液相色谱法的建立[M].第2版.张玉奎,王杰,张维冰,译.北京:华文出版社,2001:237-239.[3] 中国市场调查研究中心.中国反相色谱柱市场发展及投资价值分析报告[EB/OL].[2009-12-04].htt p://www.c m rn.co /y jl y/content2-3988.sh t m.l[4] M a j o rs R E.The clean i ng and regeneration o f reversed-phase HPLC co l u m ns[J].LC-G C Europe,2003,16(7):404-409.[5] M a j o rs R E.W ash i ng R eversed-P hase Silica-Based。

衍生化HPLC法测定水合肼的方法引言背景水合肼（Hydrazine hydrate）是一种常用的化学试剂，广泛应用于农药、染料、医药等领域。

准确测定水合肼的含量对于确保产品质量和安全非常重要。

高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分析方法，具有分离速度快、准确度高、灵敏度高等优势。

本文旨在探讨一种衍生化HPLC法测定水合肼含量的方法。

目的通过衍生化HPLC法测定水合肼的含量，提供一种准确、简便的分析方法。

实验方法试剂和仪器•试剂：水合肼、正己醛、三氟乙酸、甲醇、乙腈、纯水。

•仪器：高效液相色谱仪（HPLC）、紫外可见光谱检测器、衍生化装置。

样品制备将水合肼样品溶解于甲醇中，得到一定浓度的水合肼溶液。

衍生化反应将水合肼溶液加入正己醛、三氟乙酸混合液中，混合均匀后在室温下反应一定时间，直至反应完全。

色谱条件•色谱柱：C18色谱柱，柱温25℃。

•流动相：甲醇和纯水的混合溶液（甲醇/纯水，体积比例为70:30）。

•流速：1 mL/min。

•检测波长：254 nm。

校准曲线的绘制准备一系列浓度不同的标准溶液，使用上述色谱条件进行衍生化HPLC分析。

得到峰面积与水合肼浓度之间的关系，绘制标准曲线。

样品分析将衍生化反应后的水合肼样品进行HPLC分析，使用标准曲线计算水合肼的含量。

结果与讨论衍生化反应条件优化在反应条件优化实验中，我们尝试了不同的反应温度、反应时间和試剂用量。

发现在室温下反应30分钟，正己醛和三氟乙酸的体积比例为1:1时，反应效果最好，得到的衍生化产物稳定性较高。

校准曲线的线性范围与检测限通过分析不同浓度的标准溶液，我们得到了水合肼的校准曲线。

线性范围为0.1-100 μg/mL，相关系数（R^2）为0.999。

检测限为0.05 μg/mL。

方法验证采用实验室自制的质控样品进行方法的验证，结果表明该方法具有良好的重现性和准确性。

样品分析结果对不同来源的水合肼样品进行了分析，结果如下： 1. 样品A的含量为80 μg/mL；2. 样品B的含量为110 μg/mL；3. 样品C的含量为95 μg/mL。

化介质R4)至转化器
45 ~50°C 转化10— 20 分钟
NEX
T
PTH 氨基酸溶解于一种合适的溶剂混合物(S4)
(如20 %乙腈水溶液含或不含乙酸钠添加剂以调节
pH) 这样可直接注入在线HPLC 系统的HPLC 上柱
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应用：全自动蛋白质测序仪
结
果
分
析
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运行空白循环
苯乙内酰硫脲衍生物
苯乙内酰硫氨基酸
具体操作：
萃取出释放的氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳
定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH．氨基酸)
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Edman降解法的优点
✓异硫氰酸苯酯与所有氨基酸残基的反
应产率和回收率都相当高，因此反应副
产物少，用色谱可以准确鉴定。
✓对大多数氨基酸残基而言，30 min的
(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽
链数目、多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质
生物功能的基础。
蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研
究的基础。
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测序要求
●1 样品必需纯（>97%以上）
●2 知道蛋白质的分子量；
●3 知道蛋白质由几个亚基组成；
●4 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分
全自动蛋白质测序仪全自动蛋白质测序仪输送几微升无水三氟乙酸tfa4548c反应惰性气体流干燥除酸atz氨基酸丁基氯溶液输送人转化器重复丁基氯抽提输送丁基氯以溶解释放的苯胺唑啉酮atz输送2540无水三氟乙酸水溶液转化介质r4至转化器4550c转化1020分钟pth氨基酸溶解于一种合适的溶剂混合物s4如20乙腈水溶液含或不含乙酸钠添加剂以调节ph这样可直接注入在线hplc系统的hplc运行pth氨基酸并校准将每个循环切割下来的氨基酸于pth氨基酸进行比较并与前后循环的氨基酸进行比较确定n末端氨基酸序列运行空白循环end