线粒体DNA在昆虫系统学研究中的应用_徐庆刚

三种蛾类线粒体基因组及双孔次目（鳞翅目：有喙亚目）相关类群的系统发生分析双孔次目是鳞翅目、有喙亚目下的一个全变态昆虫类群,全世界已知种类超过157 000多种,包括全部的蝶类和大多数的蛾类,占全部鳞翅目种类的99%左右。

该类昆虫分布十分广泛,与人类的生产和生活活动密切相关,在自然生态系统中占有极其重要的位置。

另外,其中的一些类群已成为昆虫学和进化生物学相关领域重要的研究对象和模式生物。

然而,迄今为止,有关双孔次目各主要类群间的整体系统发生关系格局尚不明晰,一些类群的系统学地位等问题还存在很多争议,特别是基于形态学和分子生物学的一些研究结果还远未达成共识。

昆虫的线粒体基因组是大小为15¹9 kb的共价闭环分子,通常包含13个蛋白质编码基因（PCG）、2个rRNA基因,20余个tRNA基因和一个非编码的AT富集区（AT-rich region）。

由于它分子量相对较小,携带较为丰富的遗传信息,母系遗传等特点,现已被广泛运用于昆虫其他动物类群的系统分类学的研究中。

为了进一步解析双孔次目及其内部有关类群的系统发生关系,本研究新测了3种蛾类（玉带斑蛾、铅斑钩蛾和白缘寡夜蛾,分属于斑蛾总科,钩蛾总科和夜蛾总科）的线粒体基因组全序列,结合已知的其他双孔次目昆虫代表种类的线粒体基因组序列数据,对它们的线粒体基因组结构和组成做了详尽的比较分析;另外,根据13个蛋白质编码基因的核苷酸序列数据,运用贝叶斯演绎法（BI）最大似然法（ML）重建了双孔次目共72个代表种类的系统发生树,以此探讨它们主要类群之间的系统发生关系。

与此同时,结合GenBank中已知有关基因序列数据,以贝叶斯演绎法、最大似然法和邻接法（NJ）法的方法重建了3个总科（斑蛾总科,钩蛾总科和夜蛾总科）内部有关类群代表种群间的系统发生关系。

线粒体基因组比较分析的研究结果显示,玉带斑蛾、铅斑钩蛾和白缘寡夜蛾的线粒体基因组长度分别是15 383bp、15 564bp、15 320bp。

自然科学进展　第17卷　第8期　2007年8月用线粒体Cyt b 基因序列探讨冬虫夏草寄主蝠蛾的系统进化关系3程　舟1,233　耿　杨1　梁洪卉1　杨晓伶1　李　珊1朱云国1　郭光普1　周铜水2　陈家宽21.同济大学生命科学与技术学院,上海200092;2.教育部生物多样性与生态工程重点实验室,复旦大学生物多样性研究所,上海200433　2006211230收稿,2007201205收修改稿　3上海市科委中药现代化专项(03DZ19547)资助项目　33E 2mail :chengzhou @摘要 为探讨冬虫夏草寄主蝠蛾种属间的系统进化关系,采用C TAB 法分别从18个冬虫夏草居群的虫草虫体头部和2种寄主蝠蛾中提取基因组DNA ,PCR 扩增获得冬虫夏草寄主线粒体Cyt b 基因片段序列.结合GenBank 中的蝙蝠蛾科24种冬虫夏草寄主的同源序列,构建NJ 系统树.结果表明,双栉蝠蛾属(B i pectil us )先于蝠蛾属(Hepi al us )和类蝠蛾属(Hepi aliscus )分化;蝠蛾属的冬虫夏草寄主种类众多形态各异,且均有特定的地理分布,蝠蛾属的种间遗传分化也较明显,蝠蛾属可能是多系起源;Cyt b 基因序列在冬虫夏草寄主蝠蛾种属间存在较丰富的变异,在蝠蛾属中除草地蝠蛾和金沙蝠蛾的该段序列完全一致外,其他种类蝠蛾种间变异率为0.23%—9.24%,Cyt b 基因序列可用于冬虫夏草寄主昆虫种的鉴定,但有必要获取更多种类的寄主昆虫来进一步验证.通过对冬虫夏草虫体头部提取的DNA 进行PCR 扩增获得其寄主蝠蛾Cyt b 基因序列的方法准确有效,有助于进一步获取更多的基因序列对更多的冬虫夏草居群和寄主种类进行系统发育、居群遗传结构及菌虫相互关系等研究.关键词 线粒体Cyt b 基因　冬虫夏草　蝠蛾属　系统发育 冬虫夏草(Cordyceps )系麦角菌科真菌(Cordyceps si nensis [Berk.]Sacc.)寄生在蝙蝠蛾科(Hepiali 2dae )昆虫幼虫上所形成的子座及幼虫尸体的复合体[1,2].冬虫夏草主要分布在我国青海、西藏、云南、四川等地海拔3000—5100m 的高寒草甸区,具有补肺益肾、止血化痰等功效,是我国珍稀名贵中药材之一[1—3].冬虫夏草在形态上包括上部的冬虫夏草菌(C.si nensis )和下部的蝠蛾(Hepi al uss p p.)[2,3].迄今为止,对冬虫夏草及相关物种已有一定的调查研究[4—12],认为中国被毛孢(H i rs utell a si nensis Liu ,Guo ,Yu et Zeng ,sp.nov )为冬虫夏草的无性型[7—10],而其寄生的蝠蛾不止一种,根据传统形态分类发现并已报道的就有4属68种之多,其来源非常复杂[11,12].冬虫夏草寄主主要是蝠蛾属Hepi al us 昆虫,另外可能有少数种类的类蝠蛾属Hepi aliscus 、二岔蝠蛾属Forkal us 和双栉蝠蛾属B i pectil us 昆虫与冬虫夏草的寄生有关.目前对冬虫夏草寄主的研究多基于形态特征和生物学特性分析[13—15],也有对我国蝠蛾属昆虫的种类和地理分布的研究[11],但对我国不同产地冬虫夏草寄主之间的遗传关系还知之甚少,这直接影响冬虫夏草资源的保护和有效利用.由于昆虫线粒体DNA (mtDNA )具有结构简单、不含间隔区和内含子、无重复序列、遵守严格的母5401系遗传、几乎不发生重组、进化速率快且不同区域进化速度存在差异等特点,通过mtDNA 来揭示昆虫各类群的系统发育关系已成为当前昆虫分子系统学研究的热点.其中,细胞色素b (cytochrome b ,简称Cyt b )位于线粒体内膜磷脂双层中,在呼吸链的电子传递过程中起重要作用.Cyt b 是线粒体13个蛋白质编码基因中结构和功能被研究得最为清楚的基因之一,且进化速度适中,适合种属水平的系统发育关系的研究,被认为是解决分类及系统进化问题最可信的分子标记之一[16—19],已成为昆虫分子进化、遗传及系统发育等研究中最常用的标记之一[20—23].Guryev 等[22]根据线粒体Cyt b 和CO Ⅰ基因推断了双翅目摇蚊属(Chi ronom us )的系统发育关系.Cruz 和Whiting [23]通过Cyt b 和CO Ⅱ基因序列分析了秘鲁6个地区的蚤目昆虫Pulex si m ul ans 种群的遗传及系统地理结构.陈永久等[24]用Cyt b 基因序列分析了中国5种珍稀绢蝶的系统进化.代金霞等[25]基于Cyt b 基因序列探讨了蝽亚科11种昆虫的系统发育关系.陈永久等[26]曾利用线粒体Cyt b 基因序列首次分析了5种冬虫夏草寄主蝠蛾的分子进化关系,但对我国冬虫夏草寄主蝠蛾种属之间的系统进化关系还知之甚少.本文通过对我国主要产地冬虫夏草寄主蝠蛾的线粒体Cyt b 基因片段的序列分析,构建分子系统树,并探讨冬虫夏草寄主蝠蛾种属的系统进化关系和地域分布格局,为冬虫夏草的产地鉴定及进一步研究冬虫夏草菌与其寄主蝠蛾的相互关系提供科学依据.1　材料和方法1.1　实验材料用于本实验的18个冬虫夏草居群于2004年5月至7月间分别采自青海、西藏、四川和云南四省区(表1和图1).玉树蝠蛾(Hepi al us y us huensis Chu et Wang )和拉脊蝠蛾(H.l a gii Yan )分别于同期采自青海省玉树县和湟中县(拉脊山),用于比较从同一地点采集到的冬虫夏草居群的寄主和蝠蛾(玉树居群—玉树蝠蛾、湟中居群—拉脊蝠蛾)的Cyt b 基因序列是否一致?从冬虫夏草虫体DNA 和蝠蛾DNA 所扩增出的序列是否存在差异?冬虫夏草及两种蝠蛾均由青海省畜牧兽医科学院徐海峰先生鉴定.表1　18个冬虫夏草居群的采集地、海拔及经纬度居群及编号采集地海拔高度/m经度(E )纬度(N )玛沁MQ 青海玛沁县4200100°26′34°49′玉树YS 青海玉树县450096°97′33°03′杂多ZD 青海杂多县430095°03′32°92′祁连QL 青海祁连县2700100°22′38°02′湟中HZ 青海湟中县2260101°57′36°49′刚察GC 青海刚察县3200100°17′37°32′天峻TJ 青海天峻县320099°03′37°28′共和GH 青海共和县3200100°61′36°27′兴海XH 青海兴海县430099°99′35°06′贵南GN 青海贵南县3100100°75′35°57′河南HN 青海河南县3600101°62′34°75′米林ML 西藏米林县370094°08′29°11′林芝L Z 西藏林芝县300094°15′29°35′丁青DQ 西藏丁青县430095°38′31°25′石渠SQ 四川石渠县420098°06′33°01′康定KD 四川康定县4200101°57′30°02′香格SG 云南香格里拉县450098°72′27°78′德钦TQ云南德钦县355998°56′28°29′6401自然科学进展　第17卷　第8期　2007年8月图1　18个冬虫夏草居群样品采集地分布图居群编号同表11.2　D NA提取,从冬虫夏草玉树居群和共和居群中分别选取10个虫草,提取DNA,用于扩增寄主蝠蛾线粒体Cyt b基因片段,结果显示寄主蝠蛾Cyt b基因片段序列在冬虫夏草居群内没有差异.因此,本研究从每个冬虫夏草居群中随机选取1个虫草,取虫草虫体头部材料约10mg,采用C TAB法提取DNA,该DNA为冬虫夏草菌基因组DNA和寄主蝠蛾基因组DNA的混合物,并用0.7%的琼脂糖凝胶检测DNA质量[27].从玉树蝠蛾和拉脊蝠蛾居群样品中分别随机选取一只蛾子,取20mg,用上述同样的方法提取蝠蛾基因组DNA.1.3　PCR扩增及序列测定采用Cyt b基因扩增引物CB1:5′2TA T GTAC2 TACCA T GA GGACAAA TA TC23′和CB2:5′2A T2 TACACC TCC TAA T T TA T TA GGAA T23′[28],对上述冬虫夏草菌虫总DNA和蝠蛾基因组DNA进行寄主蝠蛾线粒体Cyt b基因的PCR特异性扩增.反应体系50μL含:2mmol/L MgCl2,0.25mmol/L dN TPs,0.2μmol/L引物,50ng模板,1×buffer 和2U Ex TaqDNA聚合酶(Ta KaRa).使用Eppen2 dorf Mastercycler Gradient PCR仪进行扩增反应,扩增条件为94℃预变性5min;40个循环:94℃变性45s,46℃退火60s,72℃延伸60s;最后72℃延伸10min.将PCR扩增产物经电泳检测纯化后由上海基康生物技术有限公司测序.1.4　系统发育分析应用Clustal X软件[29]进行DNA序列的对位排列并人工校正.使用M EGA3.1软件[30],由全部排列位点的序列变异经成对删除后计算Kimura双参数距离,用邻接法(neighbor2joining,NJ)对18个冬虫夏草居群的寄主蝠蛾及玉树蝠蛾和拉脊蝠蛾构建分子系统树.并用本实验的20个Cyt b基因片段序列和GenBank中的冬虫夏草寄主蝠蛾的同源序列进行冬虫夏草寄主蝠蛾的系统发育分析,以家蚕(B omby x mori)作为外类群(表2).遗传距离模型选择K imura双参数模型,并采用重复抽样分析1000次检验分子系统树各分支的置信度.表2　冬虫夏草主要寄主蝠蛾、分布地区[11,12]及G enB ank基因序列编号物种分布地区或采集地Cyt b序列GenBank登录号Hepial us y ushuensis玉树蝠蛾青海(玉树)、西藏A F124322H.meny uanicus门源蝠蛾青海(门源)A F124323H.obli f urcus斜脉蝠蛾青海、四川A F124319H.baqingensis巴青蝠蛾西藏(巴青)A F124304H.j ialangensis甲郎蝠蛾西藏(梅里雪山)A F124318H.z aliensis察里蝠蛾西藏(察里雪山)A F124327H.dong y uensis东隅蝠蛾西藏、云南A F124328H.dam x ungensis当雄蝠蛾西藏(当雄)A F124313H.armoricanus虫草蝠蛾四川、云南A F124303H.kang dingroi des康定蝠蛾四川(康定)A F124301H.litangensis理塘蝠蛾四川(理塘)、西藏A F124302H.p ratensis草地蝠蛾云南(白马雪山)A F124308H.j inshaensis金沙蝠蛾云南(金沙江沿西岸)A F124307H.f errugineus锈色蝠蛾云南(白马雪山)A F1243207401自然科学进展　第17卷　第8期　2007年8月续表物种分布地区或采集地Cyt b序列GenBank登录号H.bai maensis白马蝠蛾云南(白马雪山)A F124314H.albi pict us白纹蝠蛾云南(人支雪山)A F124310H.renz hiensis人支蝠蛾云南(人支雪山)A F124315H.callini valis美丽蝠蛾云南(美丽雪山)A F124309H.anomopterus异翅蝠蛾云南(老君山西北坡)A F124325H.j ianchuanensis剑川蝠蛾云南(老君山畜牧场)A F124311H.y unnanensis云南蝠蛾云南(老君山西北坡)A F124324H.y ulongensis玉龙蝠蛾云南(玉龙雪山)A F124316H.l uquensis碌曲蝠蛾甘肃(碌曲)、青海A F124312 Hepialiscus syl vi nus丫纹类蝠蛾四川(康定)A F124306B i pectil us y unnanensis双栉蝠蛾云南A F124305B omby x mori家蚕A F1497682　结果2.1　序列变异分析经对位排列,获得玉树蝠蛾和拉脊蝠蛾及我国主要产地18个冬虫夏草居群的寄主蝠蛾Cyt b基因编码区约433bp的碱基序列,没有发现序列缺失或插入.在该段序列的433个碱基中,有63个碱基存在变异,变异率为14.5%,表明不同产地冬虫夏草居群的寄主蝠蛾存在丰富的序列变异.DNA序列中的A+T的平均含量为75.8%,明显高于G+C含量.玉树蝠蛾和拉脊蝠蛾的该段序列与从在相同地点采集的冬虫夏草上扩增并测得的寄主蝠蛾序列完全一致,遗传距离为0(表3).序列比对结果还显示玉树蝠蛾不仅与同地采集的玉树冬虫夏草居群寄主蝠蛾的序列100%相同外,还与青海玛沁、河南和杂多及四川石渠的4个冬虫夏草居群寄主蝠蛾的序列也完全相同.拉脊蝠蛾的Cyt b基因片段序列则与同地采集的青海湟中冬虫夏草居群及兴海居群寄主蝠蛾的序列完全相同,但与近邻的贵南冬虫夏草居群有1个碱基存在变异.可见有些冬虫夏草居群在地理分布上的距离较远,但它们的寄主蝠蛾Cyt b基因片段序列没有差异,而一些地理距离较近的冬虫夏草居群的寄主蝠蛾却在Cyt b基因片段序列存在变异.2.2　不同产地冬虫夏草居群寄主蝠蛾的亲缘关系将测序获得的两种寄主蝠蛾及18个不同产地的冬虫夏草居群寄主蝠蛾的Cyt b基因片段433个碱基排列位点作为系统发育的分析位点,图2为采用M EGA软件构建的我国主要产地冬虫夏草居群寄主蝠蛾的NJ分子系统树.NJ系统树可将18个冬虫夏草居群明显地分成3支:第Ⅰ支包括分布于环青海湖地区的共和、刚察、天峻和祁连4个冬虫夏草居群,其寄主蝠蛾的关系十分接近,遗传距离仅在0—0.002之间;第Ⅱ支有西藏的林芝和米林居群,其寄主蝠蛾的关系最远,遗传距离为0.066(表3);其他12个采自青海中南部、云南香格里拉及四川康定等地的居群形成第Ⅲ支,它们的寄主蝠蛾的遗传距离在0—0.026之间,其中一些居群的寄主蝠蛾亲缘关系非常近.3个分支经1000次重复抽样后获得极高的置信度值分别为100%,95%和100%.图2　基于18个冬虫夏草居群寄主及2种蝠蛾Cyt b基因的N J系统树节点旁数据为1000次自展检验后置信度值(%);居群编号同表18401自然科学进展　第17卷　第8期　2007年8月表3　18个冬虫夏草居群寄主及2种蝠蛾之间的Kimura22parameter遗传距离居群a)或寄主MQ YS K D SG ZD SQ HN DQ TQ HZ GN XH ML L Z TJ GC GH QL H.y ushuensis MQ—YS0.000—K D0.0190.019—SG0.0090.0090.019—ZD0.0000.0000.0190.009—SQ0.0000.0000.0190.0090.000—HN0.0000.0000.0190.0090.0000.000—DQ0.0020.0020.0160.0120.0020.0020.002—TQ0.0090.0090.0230.0090.0090.0090.0090.012—HZ0.0120.0120.0260.0120.0120.0120.0120.0140.016—GN0.0090.0090.0230.0090.0090.0090.0090.0120.0140.002—XH0.0120.0120.0260.0120.0120.0120.0120.0140.0160.0000.002—ML0.0920.0920.0940.0940.0920.0920.0920.0890.0890.1020.1000.102—L Z0.0940.0940.0960.0940.0940.0940.0940.0910.0890.0970.0940.0970.066—TJ0.0760.0760.0830.0810.0760.0760.0760.0730.0760.0890.0860.0890.0780.078—GC0.0730.0730.0810.0780.0730.0730.0730.0710.0730.0860.0840.0860.0760.0760.002—GH0.0730.0730.0810.0780.0730.0730.0730.0710.0730.0860.0840.0860.0760.0760.0020.000—QL0.0730.0730.0810.0780.0730.0730.0730.0710.0730.0860.0840.0860.0760.0760.0020.0000.000—H.y ushuensis0.0000.0000.0190.0090.0000.0000.0000.0020.0090.0120.0090.0120.0920.0940.0760.0730.0730.073—gii0.0120.0120.0260.0120.0120.0120.0120.0140.0160.0000.0020.0000.1020.0970.0890.0860.0860.0860.012 a)居群编号同表12.3　冬虫夏草寄主蝠蛾的系统发育分析用本实验获得的玉树蝠蛾和拉脊蝠蛾及18个不同产地冬虫夏草居群寄主的Cyt b基因片段序列(433个碱基)和GenBank中的蝙蝠蛾科蝠蛾属22种、类蝠蛾属1种、双栉蝠蛾属1种的冬虫夏草寄主及家蚕科家蚕的同源序列构建的NJ分子系统树见图3.冬虫夏草的主要寄主蝠蛾属昆虫与可能寄主类蝠蛾属和双栉蝠蛾属昆虫在系统树上均以几乎100%的置信度值被分开,其中类蝠蛾属丫纹类蝠蛾和蝠蛾属各种的关系相对较近.而双栉蝠蛾属双栉蝠蛾与上述2属的关系则相对较远.从蝠蛾属内种间系统关系看,冬虫夏草的各种寄主蝠蛾及18个冬虫夏草居群的寄主蝠蛾在NJ系统树上仍可以分为3大支,各支均有较高的置信度值.18个冬虫夏草居群的寄主蝠蛾除西藏的林芝和米林居群仍单独聚成第Ⅱ支外,环青海湖地区4个居群的寄主蝠蛾和蝠蛾属的4种寄主蝠蛾形成第Ⅰ支,其他12个居群的寄主蝠蛾和蝠蛾属的20种寄主蝠蛾聚为第Ⅲ支.结合18个冬虫夏草居群的采集地和其他蝠蛾属各种冬虫夏草寄主蝠蛾的分布区分析表明,冬虫夏草寄主蝠蛾存在较为明显的地域分布特征,大多数居群采集地或栖息地较近的寄主蝠蛾其系统关系也较近.如在第Ⅲ支中的寄主蝠蛾大致可以分成青海南部—西藏北部、青海中部、云南—西藏东部、四川等4个区域.也有少数居群采集地或栖息地较远的寄主蝠蛾其系统关系则较接近,如在第Ⅰ支中,环青海湖地区的居群的寄主蝠蛾与云南的玉龙蝠蛾及剑川蝠蛾的关系相对较近.3　讨论昆虫基因组DNA的提取一般均采用蛋白酶K 一酚/氯仿抽提法[24—26].本研究采用CTAB法从寄主蝠蛾和冬虫夏草虫体头部均能获得质量较好的基因组DNA,并能扩增出冬虫夏草寄主线粒体Cyt b 基因片段.而且从相同地点采集到的冬虫夏草及其寄主蝠蛾上扩增并测得的Cyt b基因序列完全一致.此外,康定和香格里拉冬虫夏草居群扩增出的寄主蝠蛾Cyt b基因序列分别与GenBank上的康定蝠蛾及云南蝠蛾也一致(图3).可见,通过对冬虫夏草虫体头部提取的DNA进行PCR扩增获得其寄主蝠蛾Cyt b基因序列的方法不仅可行而且准确有效.从冬虫夏草虫体部分提取冬虫夏草菌和寄主蝠蛾的基因组DNA,特异性扩增寄主蝠蛾的各种基因序列,分析寄主蝠蛾的遗传变异,可以将不同产地冬虫夏9401自然科学进展　第17卷　第8期　2007年8月图3　基于18个冬虫夏草居群寄主及26种蝠蛾Cyt b基因的N J系统树节点旁数据为1000次自展检验后置信度值(%);居群编号同表1草居群的寄主蝠蛾区分开来,并作为鉴定冬虫夏草产地的依据之一.该方法使得在居群水平上同时评价冬虫夏草菌及其寄主蝠蛾的遗传多样性并探讨冬虫夏草菌虫间的相互关系成为可能.本研究采用通用引物CB1和CB2[28]扩增获得的冬虫夏草寄主蝠蛾Cyt b基因片段为433bp,和绢0501自然科学进展　第17卷　第8期　2007年8月蝶[24]、蝽亚科昆虫[25]等的该段序列长度一致.分析的18个冬虫夏草居群其寄主蝠蛾在线粒体Cyt b编码区的433个碱基中存在较丰富的序列变异,说明不同居群的冬虫夏草寄主有明显的遗传差异.所测得的线粒体Cyt b编码区序列变异程度(14.5%)要略大于陈永久等[26]对门源蝠蛾等5种蝠蛾间10.7%的变异.这可能与我们所分析的居群分布地域较广有关,但变异基本处在同一水平.一般在昆虫的Cyt b基因中,A+T含量明显高于G+C含量,冬虫夏草寄主蝠蛾的该段序列也符合这一特点,与其他膜翅目、鳞翅目和半翅目昆虫基本一致[24,25,31,32].根据传统形态分类发现并已报道的冬虫夏草寄主就有4属68种,主要是蝠蛾属Hepi al us昆虫[11,12],但来源非常复杂.Cyt b基因在线粒体基因组中进化速度适中,是分析科下属种间阶元关系的有效分子标记[16—19].Cyt b基因序列在蝽亚科11种昆虫的种间差异为0.9%—19.4%[25].我们对部分冬虫夏草居群扩增并测得的寄主蝠蛾Cyt b基因片段序列在居群内没有差异(数据未列出),可以推测冬虫夏草寄主蝠蛾在种内不存在该段序列上的变异.在已知线粒体Cyt b基因片段序列的蝠蛾属24种蝠蛾中,有22种蝠蛾在该段序列上均存在差异(0.23%—9.24%),不同种类的蝠蛾具有各自特有的序列,表现出非常明显的种间遗传多样性.而两种不同的蝠蛾即草地蝠蛾(Hepi al us p ratensis)和金沙蝠蛾(He pi al us j i ns haensis)拥有相同的Cyt b基因片段序列.根据本研究目前的结果分析认为,在冬虫夏草蝠蛾属寄主中,如果Cyt b基因片段序列不同,冬虫夏草的寄主蝠蛾很可能属于不同的种;如果该段序列相同,则冬虫夏草的寄主蝠蛾有可能是同一个种,但不排除来源于不同的种.因此,Cyt b 基因序列可用于冬虫夏草寄主昆虫种的鉴定,但有必要获取更多种类的寄主昆虫来进一步验证.冬虫夏草寄主的研究多基于形态特征和生物学特性分析[11—15],但各种寄主蝠蛾之间的系统发育关系至今尚不清楚.我们根据线粒体Cyt b基因序列构建的冬虫夏草寄主蝠蛾的种属系统分化关系认为,双栉蝠蛾属要先于蝠蛾属和类蝠蛾属分化.而蝠蛾属中的大部分种是一个有共同祖先的单系类群,置信度为97%,从地理分布上看几乎包含了除环青海湖地区以外的我国大部分冬虫夏草产区.但也存在其他遗传关系相对较远的分支,推测蝠蛾属可能是多系起源.冬虫夏草蝠蛾属大部分种类的蝠蛾其分布区域较狭窄,也有一些种类像玉树蝠蛾的分布区域较广,均存在较为明显的地域分布特点,而且通常分布地域相近的蝠蛾种类之间遗传关系较近.西藏林芝和米林的两个冬虫夏草居群的寄主蝠蛾自成一支(置信度98%),且两个居群的寄主蝠蛾间的遗传关系极远,可能与林芝米林地区特殊生态环境有关.有研究表明,由于林芝米林所处的南迦巴瓦峰地区特殊的地形地貌、森林植被、小气候等,不仅其昆虫与国内外其他地点的共有种百分比都偏低,而且该地区4县鳞翅目昆虫的相似系数也较低[33].至于环青海湖地区的4个冬虫夏草居群的寄主蝠蛾为何与分布于云南的玉龙蝠蛾及剑川蝠蛾关系较近,有待进一步研究和探讨.杨大荣等[11]认为蝠蛾属各种昆虫在我国都有特定的地理位置和分布格局,常常是不同的山脉就形成不同的种类,甚至是同一山脉不同坡向、不同海拔就会形成不同的种类.我们基于不同产地冬虫夏草居群寄主及部分蝠蛾属昆虫的线粒体Cyt b序列分析认为,尽管我国蝠蛾属昆虫主要分布区青藏高原的生态地理环境类型复杂多样,导致蝠蛾属物种间的遗传和分化活跃,形成了蝠蛾属内形态各异的众多蝠蛾种类及其特定的地理分布格局,但是该属的大多数蝠蛾种类的遗传关系十分接近.从目前的研究结果来看,云南地区的冬虫夏草蝠蛾属寄主种类最多,而且种间遗传差异极大,与一些在地理距离较远区域分布的蝠蛾种类之间也有较近的关系.因此,云南地区有可能是冬虫夏草蝠蛾属寄主的多样性中心.本研究分析了部分冬虫夏草居群和寄主蝠蛾的Cyt b序列,更多的居群和寄主种类及基因序列将被进一步用于冬虫夏草寄主的系统发育、居群的遗传结构及菌虫相互关系的研究.致谢　感谢重庆市中药研究院钟国跃研究员、西藏农牧学院的卢杰老师、复旦大学生命科学学院钟扬教授、浙江农科院计东风研究员和青海省畜牧兽医科学院徐海峰先生为本研究冬虫夏草及其寄主样品的收集等提供的帮助.1501自然科学进展　第17卷　第8期　2007年8月参　考　文　献1　国家药典委员会.中华人民共和国药典一部.北京:化学工业出版社,2005,75—762　Shimit su D.Green Book51,Cord yceps.New Science Company, J apan,19783　Li SP,Tsim KW K.The biological and pharmacological proper2 ties of Cord yceps sinensis,a traditional Chinese medicine t hat has broad clinical applications.In:Packer L.ed.Herbal and Traditional Medicine2Molecular Aspect s of Healt h,New Y ork: Marcel Dekker,2004:65726834　K obayashi Y.Keys to taxa of t he genera Cordyceps and Torru2 biell a.Trans Mycol Soc Jpn,1982,23:329—3645　Chen Y J,Zhang YP,Yang YX,et al.Genetic diversity and tax2 onomic implication of Cordyceps sinensis as revealed by RAPD markers.Biochem Genet,1999,37:201—2136　K injo N,Zang M.Morphological and phylogenetic studies on Cord yceps sinensis distributed in sout hwestern China.Myco2 science,2001,42:567—5747　李增智,黄　勃,李春如,等.确认冬虫夏草无性型的分子生物学证据.菌物系统,2000,19(1):60—648　Chen YQ,Wang N,Qu L H,et al.Determination of t he ana2 morph of Cord yceps sinensis inferred from t he analysis of t he ri2 bosomal DNA internal t ranscribed spacers and5.8S rDNA.Bio2 chem Syst Ecol,2001,29:597—6079　Chen YQ,Hu B,Xu F,et al.Genetic variation of Cord yceps sinensis,a fruit2body2producing entomopat hogenic species from different geographical regions in China.FEMS Microbiol Lett, 2004,230:153—15810　蒋　毅,姚一建.冬虫夏草无性型研究概况.菌物系统,2003, 22(1):161—17611　杨大荣,李朝达,舒　畅,等.中国蝠蛾属昆虫的种类和地理分布研究.昆虫学报,1996,39(4):413—42212　刘　飞,伍晓丽,尹定华,等.冬虫夏草寄主昆虫的生物学研究概况.重庆中草药研究,2005,51:45—5213　杨大荣.云南西藏蝠蛾属四新种(鳞翅目:蝙蝠蛾科).动物学研究,1994,15(3):5—1114　刁治民.青海冬虫夏草资源及生物学特性的初步研究.生物学杂志,1996,13(2):21—2215　陈仕江,尹定华,钟国跃.冬虫夏草寄主比如蝠蛾卵的生物学研究.中国中药杂志,2003,28(11):1102—110316　Gray MW.Origin and evolution of mitochondrial DNA.Annu Rev Cell Biol,1989,5:25—5017　Meyer A,Wilson AC.Origin of tet rapods inferred from t heir mi2 tochondrial DNA affiliation to lungfish.Mol Evol,1990,31: 359—36418　Irwin DM,K ocher TD,Wilson AC.Evolution of t he cytochromeb gene of mammals.J Mol Evol,1991,32:128—14419　Zardoya R,Meyer A.Phylogenetic performance mitochondrial protein coding genes in resolving relationship among Vertebrates.Mol Biol Evol,1996,13:933—94220　Lee ES,Shin KS,K im MS,et al.The mitochondrial genome of t he smaller tea tortrix A dox op hyes honmai(Lepidoptera:Tort ri2 cidae).Gene,2006,373:52—5621　Pereira F,Meirinhos J,Amorim A,et al.Analysis of inter2spe2 cific mitochondrial DNA diversity for accurate species identifica2 tion.International Congress Series,2006,1288:103—10522　Guryev V,Makarevitch I,Blinov A,et al.Phylogeny of t he ge2 nus Chi ronom us(Diptera)inferred from DNA sequences of mito2 chondrial cytochrome b and cytochrome oxidase I.Molecular Phylogenetics and Evolution,2001,19(1):9—2123　Cruz KD,Whiting MF.Genetic and phylogeographic structure of populations of Pulex si mul ans(Siphonaptera)in Peru inferred from two genes(Cyt b and COII).Parasitol Res,2003,91:55—5924　陈永久,张亚平,沈发荣,等.中国5种珍稀绢蝶非损失性取样的mtDNA序列及系统进化.遗传学报,1999,26(3):203—207 25　代金霞,郑哲民.基于Cyt b基因序列探讨蝽亚科11种昆虫的系统发育关系.昆虫知识,2005,42(4):395—39926　陈永久,杨大荣,杨跃雄,等.青臧高原七个地区冬虫夏草的分子进化研究.中国科协第三届青年学术年会《材料科学与工程技术论文集》,北京,1998,87—8927　梁洪卉,程　舟,杨晓伶,等.青海省冬虫夏草的遗传变异及亲缘关系的形态性状和ISSR分析.中草药,2005,36:1859—186428　Simon C,Frati F,Beckenbach A,et al.Evolution,weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers.Ann Entomol Soc Amer,1994,87(6):651—70129　Thompson JD,G ibson TJ,Plewniak F.The Clustal X windows interface:flexible strategies for multiple sequences alignment ai2 ded by quality analysis tools.Nucleic Acids Res,1997,25: 4876—488230　Kumara S,Tamura K,Nei M.MEGA(Molecular evolutionary genetics analysis),Version3.0.Tempe:Arizona State Univer2 sity,200131　J ermiin L Z,Crozier R H.The Cytochrome b region in t he mito2 chondrial DNA of t he ant Tet raponera ru f oni ger:Sequence di2 vergence in Hymenoptera may be associated wit h nucleotide con2 tent.J Mol Evol,1994,38:282—29432　Brower AVZ.Phylogeny of Heliconi us butterflies inferred from mitochondrial DNA(Lepidoptera:Nymphalidae).Mol Phy Evol, 1994,3:159—17433　卢　杰,唐晓琴.南迦巴瓦峰地区昆虫及其区系分析.西藏科技,2006,(5):55—602501自然科学进展　第17卷　第8期　2007年8月。

第34卷第4期2018年4月科技通报BULLETIN OF SCIENCE AND TECHNOLOGYVol．34No．4Apr．2018分子生物技术在昆虫系统发育研究中的应用胡庆玲1，2，宁硕瀛3（1．陕西省河流湿地生态与环境重点实验室，陕西渭南714000；2．渭南师范学院化学与环境学院，陕西渭南714000；3．西北农林科技大学植保资源与病虫害防治教育部重点实验室，陕西杨凌712100）摘要：分子生物技术在昆虫系统发育研究中具有重要作用，该技术在昆虫的鉴定分类，研究种群系统发育关系等方面应用广泛。

本文主要从分子生物技术的研究材料，技术方法和应用三方面展开论述，并展望了分子生物技术未来在系统发育中的应用前景。

关键词：分子生物技术；系统发育；分子标记；应用中图分类号：Q966文献标识码：A文章编号：1001－7119（2018）04－0007－08DOI ：10.13774/j．cnki．kjtb．2018.04.002Application of Molecular Biological Techniques in Insect PhylogenyHu Qingling 1，2，Ning Shuoying 3（1．Key Laboratory for Ecology and Environment of Ｒiver Wetlands in Shaanxi ，Shanxi Weinan 714000，China ；2．Weinan Normal University ，College of Chemistry and Environment ，Shanxi Weinan 714000，China ；3．Key Laboratory of Plant Protection Ｒesources and Pest Management of Ministry of Education ，Northwest A＆F University ，Shanxi Yangling 712100，China ）Abstract ：Molecular biology techniques plays an important role in the research of insect phylogeny．It is widely used in the identification and classification of insects ，and in the research of phylogenetic relationships ，etc．This paper mainly discussed the molecular biology techniques from the aspects of research materials ，technical methods and its application．At last ，the prospect of the application of molecular biology technology in the system development prospects in the future．Keywords ：molecular biological techniques ；phylogeny ；molecular marker ；application 收稿日期：2017－05－19基金项目：陕西省高校科协青年人才托举计划项目（20160235）；陕西省河流湿地生态与环境重点实验室开放基金（SXSD1405）；渭南师范学院自然科学类科研计划项目（14YKP002）；渭南师范学院人才基金科研项目（15ZＲＲC03）；渭南师范学院特色学科项（14TSXK04、14TSXK05）。

中国蛉蟋科分子系统学研究（直翅目：蟋蟀总科）蛉蟋科Trigonidiidae隶属于直翅目Orthoptera、蟋蟀总科Grylloidea。

蛉蟋科下分针蟋亚科Nemobiinae和蛉蟋亚科Trigonidiinae两亚科,我国蛉蟋科种类已知18属7亚属83种。

蛉蟋科蟋蟀体型较小,早期国内外学者对于蛉蟋科的研究主要集中在经典分类学,多见于新种的描述,但其属种间的关系仍不明了,且不少物种的归属问题不确定。

目前,分子系统学已广泛应用于动物、植物及微生物等的系统发育研究,但蛉蟋科昆虫中还未见相关研究报道。

为了厘清中国蛉蟋科属种间关系,减小经典分类学上容易出现的人为误差,本研究首次通过分子系统学方法,探讨中国蛉蟋科昆虫的系统发育关系。

本研究使用四个线粒体基因片段12SrRNA、16SrRNA、Cytb、COI和两个核基因片段18SrRNA、28SrRNA研究蛉蟋科12属42种共103个体,通过最大似然法和贝叶斯法构建中国蛉蟋科系统发育树,从而为蛉蟋科分子系统学研究提供丰富数据。

具体研究结果如下:1.通过PCR扩增成功获得了12SrRNA基因序列101条、16SrRNA基因序列97条、Cytb基因序列97条、COI基因序列96条、18SrRNA 基因序列93条、28SrRNA基因序列101条,共计585条基因序列。

2.支持针蟋亚科和蛉蟋亚科的单系性,且拥有很高的支持率。

3.针蟋亚科中,4属均形成单系群,奇针蟋属Speonemobius先分化出来,双针蟋属Dianemobius、灰针蟋属Polionemobius与异针蟋属Pteronemobius聚为一支,且双针蟋属Dianemobius与灰针蟋属Polionemobius亲缘关系更近。

4.蛉蟋亚科中,7属均形成单系群,小黄蛉蟋属Natula、拟黄蛉蟋属Anaxiphomorpha、墨蛉蟋属Homoeoxipha聚为一支,且拟黄蛉蟋属Anaxiphomorpha与墨蛉蟋属Homoeoxipha亲缘关系更近;拟蛉蟋属Paratrigonidium、蛉蟋属Trigonidium、唧蛉蟋属Svistella及哑蛉蟋属Metiochodes聚为一支,且拟蛉蟋属Paratrigonidium与蛉蟋属Trigonidium亲缘关系更近。

几种蚜小蜂的分子鉴定与丽蚜小蜂线粒体基因片段的研究蚜小蜂科寄生蜂是粉虱、介壳虫、蚜虫等农林害虫的重要天敌,在害虫生物防治中发挥重要作用。

目前,蚜小蜂分类鉴定仅依靠传统分类的方法远远无法满足需要,迫切需要找到一种能够快速准确识别蚜小蜂的方法。

本研究利用在昆虫上经常使用的28S rDNA基因D2区、线粒体CO1基因3’端与5’端3种分子标记,采用DNA条形码分析方法研究蚜小蜂的分类鉴定技术,旨在探究28S rDNA基因D2区、线粒体CO1基因3’端与5’端这3种分子标记鉴定蚜小蜂的可行性,以期建立一种快速准确鉴定蚜小蜂的新方法。

基于目前线粒体全基因组对蚜小蜂科昆虫的分子研究起到越来越重要的作用,利用PCR技术进行丽蚜小蜂线粒体不同基因片段的扩增,旨在为下一步的丽蚜小蜂及其它蚜小蜂科昆虫的全基因组研究打好基础。

通过研究获得以下结果：1.在对17种蚜小蜂的CO1基因进行研究时,发现通用引物lco1490/hco2198不能很好的对这些种类进行扩增。

研究设计出一对用于扩增蚜小蜂CO1基因5’端的引物,该对引物扩增出的序列达到BOLD数据库中对于标准DNA条形码的要求。

研究共获得12种蚜小蜂的标准DNA条形码序列,其中11种序列在BOLD systems中没有收录。

2.对29种蚜小蜂28S rDNA基因D2区序列进行分析,结果显示：29种蚜小蜂种间与种内遗传距离差异为355,物种识别成功率为86.2%。

但有25种蚜小蜂的种内遗传距离为零,种内28S rDNA序列的保守性很强；夏威夷食蚧蚜小蜂Coccophagus havaiiensis与日本食蚧蚜小蜂Coccophagus japonicus种间的遗传距离为零；Encarsia brimblecombei与Encarsia normarki 种间的遗传距离为零。

Aphytis lingnanensis与Aphytis coheni种间距离与种内距离相近。

这表明该分子标记还不能很好的对蚜小蜂近缘种进行分辨,但仍可以作为属间鉴定的依据,甚至在属内不同种团间也可起到较好的鉴定作用。

四种瘿蜂科昆虫线粒体基因组测序分析及细蜂类系统发育研究瘿蜂科隶属于膜翅目(Hymenoptera)瘿蜂总科(Cynipoidea),是该总科中唯一植食性常见农林类害虫。

随着线粒体基因组序列在系统发育研究中的广泛应用,使得通过线粒体基因组探究物种在不同分类阶元的系统发育关系成为可能。

截止目前为止,NCBI中已经积累了113种膜翅目昆虫全线粒体基因组,主要集中于茧蜂、蜜蜂、姬蜂和叶蜂等个体较大的蜂类。

由于瘿蜂科昆虫个体非常小,大多数个体均小于3mm,体长范围位于1-10mm,因此瘿蜂总科仅有1种枝跗瘿蜂Ibalia leucospoides(NCBI登录号:KJ814197)获取了全线粒体基因组。

瘿蜂科所属细蜂类内部系统发育关系不明确,瘿蜂科的进化地位也存在争议。

本研究采用二代测序Illumina Hi Seq平台,对膜翅目瘿蜂总科瘿蜂科纹瘿蜂属黄纹瘿蜂Andricus flavus和Andricus sp.nov.、客瘿蜂属Synergus castaneus 和栗瘿蜂属Dryocosmus kuriphilus四种瘿蜂昆虫线粒体进行了线粒体基因组序列测定,并进行了组装、注释和分析。

利用比较基因组学与生物信息学结合的方法分析瘿蜂科线粒体基因组的特征,对瘿蜂科线粒体基因排列顺序与祖先昆虫进行了对比和说明。

计算Ka、Ks、Ka/Ks比较瘿蜂科昆虫基因在进化中是否受选择压力。

通过下载NCBI数据库中已收录的膜翅目细腰亚目细蜂类12种昆虫的线粒体基因组,基于线粒体13个蛋白质编码基因数据集,采用最大似然法(Maximum Likelihood)和贝叶斯算法(Bayesian)对细蜂类构建系统发育关系,对系统树结果进行合理分析。

主要研究结果如下:1、通过高通量测序技术测得Andricus flavus、Andricus sp.nov.、Synergus castaneus和Dryocosmus kuriphilus的线粒体基因组。

鳞翅目昆虫线粒体全基因组结构特点及其比较基因组学分析的开题报告摘要：鳞翅目昆虫是一类数量极为庞大的昆虫群体，其中包括了很多重要的农业害虫和蜜蜂等有益昆虫。

线粒体是细胞中的能量生产中心，也是昆虫分类和进化研究中的重要参考标志。

本文通过对多个鳞翅目昆虫的线粒体全基因组结构进行分析，比较其基因组学差异，以探讨不同昆虫间的进化关系。

关键词：鳞翅目昆虫，线粒体全基因组，进化关系，比较基因组学引言：鳞翅目昆虫是昆虫纲中最为多样化和最为成功的一个目，包括了蝴蝶、蛾、蜻蜓等多种昆虫，其数量极为庞大。

线粒体是细胞中的能量生产中心，也是昆虫分类和进化研究中的一个重要参考标志。

线粒体基因组结构比较简单，其不仅存在进化相关的差异，而且由于其比较保守的进化速率，成为了昆虫间分类和进化关系分析的研究热点。

通过对鳞翅目昆虫的线粒体基因组分析，可以揭示不同昆虫间的进化关系，为昆虫分类学和生物多样性保护提供有益的信息。

目的：本文旨在通过对多个鳞翅目昆虫的线粒体全基因组结构进行分析，比较其基因组学差异，以探讨不同昆虫间的进化关系。

材料与方法：本文选取了多个鳞翅目昆虫作为研究对象，利用基因组学方法对其线粒体全基因组结构进行分析，比较不同昆虫间的基因组差异。

具体步骤如下：1. 提取不同昆虫间的线粒体DNA。

2. 通过高通量测序技术获取线粒体全基因组序列。

3. 序列拼接，组装成线粒体全基因组序列。

4. 进行基因组比对和注释。

5. 对比各个昆虫间的基因组学差异，探讨其进化关系。

预期结果：通过对多个鳞翅目昆虫的线粒体全基因组结构进行分析，比较不同昆虫间的基因组差异，可以进一步揭示不同昆虫间的进化关系和生物多样性保护中的重要意义。

结论：通过对多个鳞翅目昆虫的线粒体全基因组结构进行分析，比较不同昆虫间的基因组差异，可以更好地了解各个昆虫的进化关系，为昆虫分类学和生物多样性保护提供有益的信息。

山西农业科学 2024，52（2）：78-88Journal of Shanxi Agricultural Sciences小片蝽线粒体基因组及蝽科系统发育分析刘迎香，赵清（山西农业大学 植物保护学院，山西 太谷 030801）摘要：为了从线粒体基因组水平探讨小片蝽Sciocoris lateralis 在蝽科的分类地位，丰富蝽科线粒体基因组基本数据，为蝽科系统发育进化研究提供一定的理论依据，通过高通量测序，首次测定并分析了小片蝽完整线粒体基因组（Genbank 登录号：OP531920），提取蝽科物种的13个蛋白编码串联序列（PCGs ），使用最大似然法、贝叶斯法构建系统发育树。

结果显示，小片蝽昆虫的线粒体全基因组长度为15 445 bp ，包括13个蛋白编码基因（Protein -coding genes ，PCGs ）、2个rRNA 基因（ribosome RNAs ，rRNAs ）、22个tRNA 基因（transfer RNAs ，tRNAs ）和1个控制区（Control region ）。

小片蝽线粒体基因组结构排序与其他蝽科物种一致，均无基因重排现象。

小片蝽线粒体全序列AT 含量为74.26%，GC 含量为25.74%。

13个蛋白编码基因中，cox1、nad1和nad6的起始密码子为TTG ，其余10个蛋白编码基因的起始密码子是ATT 、ATA 、ATG 。

在所测得的tRNA 基因中，trnS1和trnV 缺失DHU 臂，其他20个tRNA 均能折叠形成典型的三叶草结构。

基因错配方式主要为G -U 错配。

基于13个PCGs 构建的蝽科系统发育树结果显示，小片蝽与斑须蝽的亲缘关系最近并且位于蝽亚科分支，支持二星蝽族Eysarcorini 和Strachiini 族的单系性，而棕蝽族Caystrini 和腹沟族Halyini 互为姐妹群，这与传统形态学分类结果一致；益蝽亚科与蝽亚科曼蝽属（Menida ）形成姐妹群关系，该系统发育关系与传统形态分类学研究结果不一致。

鳞翅目线粒体基因组分析及部分蛾类DNA条形码鉴定【摘要】：线粒体基因组结构稳定、长度较小,较少发生重组,普遍为母性遗传,被广泛应用于种群遗传结构、基因漂流、谱系地理学和系统发育等研究。

鳞翅目是昆虫纲四大目之一,种类繁多,全世界已知鳞翅目昆虫约达25万种,但目前已测定的鳞翅目线粒体基因组仅34种,对于庞大的鳞翅目种群来说,十分有限。

加快鳞翅目线粒体基因组的测序和分析,对揭示鳞翅目线粒体基因组的进化和研究该类群复杂的系统发育关系有重要意义。

本文选取了鳞翅目2个种米蛾及旋纹潜叶蛾进行了线粒体基因组测序和注释,比较分析了鳞翅目34种昆虫的线粒体基因组结构、碱基组成特点、密码子使用情况、各蛋白质编码基因的进化速率。

基于线粒体基因组进行了鳞翅目高阶元系统发育分析。

鳞翅目蛾类绝大多数是农、林业害虫,而且主要在幼虫时期进行危害,构建DNA条形码数据库,可确保对蛾类幼虫的快速准确鉴定,保证防控措施的有效实施。

本文基于线粒体coxl基因对采自果园内的鳞翅目蛾类进行了调查鉴定,充实了鳞翅目DNA条形码数据库,检验了目前BOLD系统对农林害虫的鉴定成功率,检验了NJ树鉴定物种的准确度,对种内种间遗传距离进行了计算与讨论。

主要研究结果如下：1.首次测定了螟蛾总科米蛾及巢蛾总科旋纹潜叶蛾线粒体全基因组序列,并分别进行了注释,预测了tRNA和rRNA基因的二级结构,分析了A+T富含区结构。

米蛾及旋纹潜叶蛾的22个tRNA除了trns1AGN)缺少1)HU臂,其余均为典型的三叶草结构。

rrnL和rrnS的二级结构与其他鳞翅目昆虫相似。

鳞翅目线粒体coxl基因的起始密码子为CGA,为鳞翅目昆虫的共同特征。

旋纹潜叶蛾A+T富含区缺少Poly-T 区域,但该区域形成一个环状结构,很可能承担着与Poly-T相同的功能,对轻链复制起点的识别起着重要作用。

线粒体基因组中的间隔区trnQ-nad2与nad2基因的同源性很高,同源性超过60%的种类占鳞翅目已测序昆虫的91%,该间隔序列可能是由nad2基因的部分区域重复产生的。