实验家兔骨折愈合骨组织形态计量学研究

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实验家兔骨折愈合骨组织形态计量学研究

天津医院骨研所 兰耋 羹 轰魏典

摘要作者应用骨组织形态计量方法测定丁132个(术后2~90天)实验家兔骨折血台标本的

15项骨计量学指标的变化。并对所获指标数据进行丁计算机统计分析、制图处理,继而找出了骨折

自然愈合过程中的多种骨计量学指标参数。提出骨折血台过程中,类骨质生成量及矿化沉积率变化

均旱 驻峰样 政峦瑚象

国内外学者多用病理学、组织化学和超

微结构等方法对骨折愈合和促进骨折愈合的

方法进行了研究0.2]。这些研究方法所得结果

仅停留在单纯形态学水平,因而在评价骨折

愈台中常受主观因素的影响。也由于这些方

法受技术条件所限,不可能为骨折实验模型

提供一组鉴定骨折愈合速度的客观指标。而

常规观察骨折标本多进行脱钙制片,失掉了

占骨重2/S的矿物质,势必会在一定程度上

破坏骨组织形态,影响对骨折愈合的观察。

骨组织形态计量学(bone histomotphometfy

啪简称骨计量学)采用四环素活体双标记

方法,利用四环紊能与钙特异结合并沉积在

骨矿化前沿(minaralization front)的特性,在

荧光显微镜下观察骨内二次标记的四环素荧

光线距离等变化,从而求得骨矿化沉积率

(minaralization apposition rate),骨体积(bone

volume)等十数项骨动力学及骨形态学指标。

本文采用骨计量学方法测量骨折愈合各

时期中新生骨痴的各种骨计量学指标变化,

找出与观察骨折愈合有关的骨计量学指标。

从而开辟研究实验骨折愈合和鉴定骨折愈合

速度的新方法,有利于促进骨折愈合(如:中

西药物、微量元素、器械方法等)和骨折愈合

机理的研究。

材料方法

一、实验性家兔骨折模型的制备和四环

紊标记方法及不脱钙切片的制作

本次实验选用家兔70只,在戊巴比妥钠静脉麻醉下,使用三角型双锯片电动摆锯,将家兔双侧桡骨中上1/S交界处锯成3mm宽的骨折缺损。术后不傲任何固定,采用复合饲料喂养。标记四环耳缘静脉注射两次,剂量为每公斤体重50II1g,首次在处死前9天,第二次在处死前3天。共获骨折模型标本132十,其中有10只寡四环紊标记,按传统方法取材用于脱钙切片与不脱钙切片的对照观察。处

死后的家兔即刻摄双前臂x线片,截取前臂

标本放入70蝣酒精4℃ 固定三天。丙酮脱水

后,采用甲基丙烯酸甲脂和丁脂进行包埋。用

Jung K型切骨机切出7岬l厚的不脱钙切片,

再进行Giemsa。VOfl Kossa.PAS.AB_PAS.

PTAH等方法染色。分别在荧光、偏光及普通

光镜下观察。

二、骨计量学测量方法及测量指标先

将实验家兔骨折模型切片,参照传统的组织

学观察将骨折端新生骨痴分为内、外、连接骨

痴(图1)。分别在100倍及200倍荧光、偏光

和(或)普通光镜下摄不同染色切片的各骨痴

镜下视野。每1例骨折标本切片,不同骨痴部

位及观察方法下,要求摄12个以上的视野。

各术后观察组需相片50张。本次测量包括了

近万个骨折端骨痴镜下视野面积,共7百余

张相片。

⋯ ⋯ 丌”⋯

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中华骨科杂志1991年第11卷第4期 295

镜下相片的测量是采用数字化仪(housto

instrument 8024)连用IBM AT微机.使用AU—

TO-CAD软件处理,所获数据再输入微机使

用接骨计量学公式设计的统计分析程序进行

数据处理。并用医学数理统计程序 进行统

计学处理及相关回归分析、显著性检验等。

类骨质体积等有关类骨质指标的测量是

在VOrl Kossa染色[ 的不脱钙切片上拍摄的

彩色相片进行。镜下成熟骨为黑紫色,类骨质

为粉红色覆于骨小梁周边。测量单、双四环紊

标记荧光线长及宽等,均在荧光镜下摄片上

进行(图2)。测量成骨细胞表面长及骨吸收

陷窝表面长等指标是在Giemsa染色下拍摄

的彩色相片上进行。另外,对上述三种相片均

需测量骨体积(bone volume)、骨表面(bone

surface)等指标,再通过计算机求出三张相片

之平均骨体积(mean bone volume,Mev)、绝

对类骨质体积(AOV)、相对类骨质体积

(ROV)、平均类骨质宽(MOSW)、矿化沉积率

(MAR)、纠正矿化沉积率(CMAR)、及矿化延

迟时间(MLT)等共15项指标。详细测量方法

及选用指标均参照Revell、Parfltt、邱明才

等口 采用的骨计量学方法进行。

结 果

、平均骨体积(MBV) 本实验的一般

组织学观察同诸学者在骨折愈合研究所见相

同。骨折后,断端新生的内、外、连接骨痂的出

现与消失的时间不同

图2 在骨小粱周边骨矿化前婿沉积的四环素荧光枷一

记线,荧光显做镜下200X

外骨痴是骨折愈合过程中最早出现的骨

痴,术后4天就有外骨痴生成。镜下可见,骨

折端骨外膜深层的成骨细胞增殖,后经膜内

骨化成骨(intramembranous ossification),此后

外骨痴增加迅速.而且大量新生的编织骨

(woven bone)来自骨折处生成的纤维软骨性

骨痴,通过软骨内骨化成骨(endochondraI ossi—

fiction)。外骨痴新生骨小粱的MBV值,随术

后时间(44天前)的延长而迅速增加。MBV值

与术后时间曲线星抛物线状.其顶点在4 天

(最大体积值为82.61 ),而后逐渐趋于下

降(图3)。术后60天基本上被吸收而数值消

失。其曲线经幂曲线回归分析拟合良好(拟台

优度为0.9044,回归系数为0.95l0,回归方

程为y一30.8903X P<0.001)

内骨痂出现时间晚于外骨痂,约在术后

6天,它不同于外骨痴即太部分骨生成来自

软骨内骨化生骨,而多为膜内骨化生骨 镜下

可见,骨折端早期骨内膜即有增生,成骨细胞

直接生成骨小粱。内骨痂的MBV值也呈抛物

线状,其顶点在术后32天(70.54 )。40灭

以后,内骨痴基本消失(图3)。此时骨折处的

骨羹腔已经再通。

连接骨痴出现的最晚,约在术后8天。它

不同于内、外骨痂最终被吸收而消失,而是随

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)

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一联接t

外t痂

⋯ 一

圈3 内、外、连接骨痂的MBV值阿术后时同变化曲线

骨折愈合时间的延长,骨痂中MBV值逐渐增

大。组织学观察可见到由早期编织骨向板层

骨一哈弗氏系统形态结构演变的过程。连接

骨痂的MBV值呈一条对效曲线状上升,正好

说明这一现象 经统计学处理,其对效曲线拟

合良好,(拟合优度为0.9723,回归系数为

0.9816,P<0.001)且具显著意义(图8)。

二、绝对类骨质体积(AOV)、相对类骨质

体积(ROV)、相对类骨质表面(ROS)、平均类

骨质宽(MOSW)和类骨质指数(o1),此五项

指标均代表骨折愈合过程中类骨质生成效量

的变化。其效值与术后时间曲线、均呈现一种

“驼峰”样增高现象(图4,5) 其第一峰值高,

出现在骨折后的14天。此时的组织学观察,

各骨痂正处于成骨细胞增生活跃,生成大量

骨基质。骨小梁步有钙化,软骨内骨化成骨活

跃。第二峰值较低,出现在术后的36天。此时

相当于骨折愈合分期的后期,主要特点为骨

痴的成熟及骨塑形的开始。内、外骨痴体积明

显减小,髓腔部分已开始再通。此时测得的

AOV等效值不如第一峰值大,但明显高于相

邻时间各组效值而具显著性。

三、矿化沉积率(MAR)、纠正矿化沉积率

(CMAR)和矿化延迟时间(MLT)}三项指标分

别代表骨折愈合中,类骨质矿化成骨过程的

速度及时间过程。各骨痴的MAR、CMAR效

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值与术后时间曲线变化也呈一种“驼峰 样

图● 各骨癞平均的AOV值与木手时间变化曲线

(● 怖

图5 各骨蠹平均的ROY值与木后时间变化曲线

(q )蠢膏

圈6 内、外、连接骨窗的CMA

R值随术后时间变化曲线

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(图6)。在不同骨痴CMAR的高峰值出现时

间不同。按高峰值出现时间顺序依次为内、

外、连接骨痴,其间隔时间约8天。最大的矿

化沉积速度在30~50天。这种现象同一般组

织学观察到的骨折后新生骨小梁出现时间及

骨痴的形成先后顺序相似。

MLT的测量数值与术后时间曲线变化具

有明显的周期性(图7)。三个高峰值分别出

现在骨折后的ld天、24天及36天,两峰值间

隔约l0天,而数值也逐渐下降。

(d)置震/更膏

图7 各骨痴平均的MLT值与木后时间变北曲线

圈8 连接骨瘟的MBV值与木后时问的对数曲线拟台

讨 论

、平均骨体积(MBV)与骨折愈合众

所周知,骨折愈合的组织学基础是由新生骨

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小梁(及骨皮质的再建)修复折损处(或缺损)

的骨而达到愈合的过程[2],骨折后断端新生

的内、外、连接骨痴中MBV值变化.是观寨骨

折愈合与否及愈合强度、韧性的关键 本实验

首次采用骨计量学方法,找出了实验家兔骨

折自然愈合过程中,各愈合时期 各部位骨痴

MBV增加的正常值及数值与书后时间变化

曲线。并通过统计学处理证实,在骨折愈合

中,内、外骨痂MBV值与愈合时间曲线呈抛

物线状。

外骨痴是骨折后早期稳定断端的主要因

素,形成时间早,最大MBV值在术后4d天

(82.61 ),能在骨折后的早期承受断端的扭

力和拉伸力从而恢复折骨的功能。内骨痴为

暂时起连接断端作用,又最早的在骨塑形中