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苏教版选修1第二节《制备和应用固定化酶》教案

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第三章 苏教版选修1第二节《制备和应用固定化酶》教案

3.2制备和应用固定化酶

探究目的：

1、说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理

2、尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。

探究预习：

固定化酶技术的发展也促进了固定化细胞技术的发展。20世纪70年代后期出现了固定化细胞技术。通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞固定化。固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，由于保留了细胞内原有的多酶系统，这对多步催化的连续反应优势就更加明显。细胞固定化的方法也有多种，主要是吸附法和包埋法两大类。

吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地附着在容器壁、微载体和中空纤维等载体上。吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。

包埋法是指将细胞包埋在多孔载体的内部而制成固定化细胞的方法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。

海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操作简便，条件温和，对细胞无毒性。通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。用海藻酸钠凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产与研究。

固定化细胞技术可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。

材料用具：干酵母，聚乙烯醇，海藻酸钠，无水CaCl2，蒸馏水，烧杯，玻璃棒，酒精灯，三角架，石棉网，注射器等。

探究过程：

探究步骤 探究记录 结论或解释

1. 实验准备 准备各种实验药品和器具。

2.制备麦芽汁 称取一定质量的干麦芽粉，加入其质量4倍的水，在58~65℃下糖化3-4 h。每隔一定的时间用碘液测定，如果仍显蓝色，说明糖化还不完全，继续糖化直至不显色为止，得到麦芽汁。煮沸、冷却麦芽汁后用纱布过滤，再调节pH至6.0，在121℃下灭菌15min，制成无菌麦芽汁。

3.活化酵母菌细胞 称取1g干酵母放入50 mL的小烧杯中，加入蒸馏水10

mL。用玻璃棒搅拌酵母菌液，使其活化1h左右。

4.制备固定化细胞 称取4g聚乙烯醇（PVA）和0.2 g海藻酸钠，加入无菌水40 mL，适当加热至完全溶化，将溶液冷却至45℃，加入预热至35℃的酵母菌培养液，混合均匀形成酵母菌-海藻酸钠胶液；将酵母菌-海藻酸钠胶液倒入带有孔径为2 mm喷嘴的小塑料瓶或吸入注射针筒中；以恒定的速度滴入预先盛有50 mL饱和硼酸-氯化钙溶液的烧杯中，采用磁力搅拌器或手摇的方法使溶液不停地旋转；酵母菌-海藻酸钠胶液在溶液中逐渐形成凝胶珠。待凝胶珠在溶液中浸泡30 min后，取出用无菌水洗涤3次备用。

5.发酵麦芽汁 将固定化酵母菌细胞凝胶珠加入300 mL无菌麦芽汁中，置于25℃下发酵7~9 d。待发酵结束后品尝其味道。

探究反思：

固定化酵母菌技术有哪些优点？

2 / 5探究示例：

请参照细胞固定化技术的相关基础知识，完成下列问题。

（1）细胞固定化技术一般采用包埋法固定化，采用该方法的原因是____________________________________________________________________。

（2）包埋法固定化是指_________________________________。

（3）包埋法固定化细胞常用的载体有____________________________________

______________________。（答出三种即可）

（4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的优点是________________________________________________。

（5）制备固定化酵母细胞的步骤为：

①________________________________________________。

②_________________________________________________。

③___________________________________________。

④________________________________________________。

⑤__________________________________________________。

【解析】（1）固定化细胞的方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法，一般来说多采用包埋法固定化，因为个大的细胞难以被吸附或结合，且不易从包埋材料中漏出。

（2）（3）包埋法固定化即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠等。

（4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的成本更低．操作更容易。

（5）制备固定化酵母细胞的程序为：酵母细胞的活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞。

【答案】（1）细胞个大，不易从包埋材料中漏出；（2）将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中；（3）明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等；（4）成本更低，操作更容易；（5）①酵母细胞的活化 ②配制CaCl2溶液 ③配制海藻酸钠溶液 ④海藻酸钠溶液与酵母细胞混合 ⑤酵母细胞的固定化。

【矫正反馈】

1．固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，其中适合细胞固定的方法是（ ）

A．包埋法 B．物理吸附法 C．化学结合法 D．高温冷却法

2．与固定化酶相比，固定化细胞制备的特点是（ ）

A．成本高，但操作更容易 B．成本低，但操作更复杂 C．成本高，且操作更复杂 D．成本低，且操作更容易

3．固定化细胞技术在废水处理中有着重要作用，用于处理含氮、氨丰富的废水的固定化微生物通常是（ ）

①酵母菌 ②青霉菌 ③硝化菌 ④反硝化菌

A．①② B．③④ C．①③ D．②④

4．酵母细胞的活化是指（ ）

A．让酵母细胞恢复运动状态 B．让酵母细胞在缺水状态下休眠

C．让酵母细胞内酶活性加倍 D．让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态

5．下面为制备固定化酵母细胞的步骤，其正确的操作程序是（ ）

①海藻酸钠溶液与酵母细胞混合 ②配制海藻酸钠溶液 ③酵母细胞的活化 ④固定化酵母细胞 ⑤配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaCl2溶液

A．①②③④⑤ B．③①②⑤④ C．③⑤②①④ D．③②⑤①④

6．试分析下图中，哪一种与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母细胞相似（ ）

7．下列有关固定化酵母细胞制备步骤叙述，不恰当的是（ ）

A．应使干酵母与水混合并搅拌，以利于酵母菌活化

B．配制海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法

3 / 5C．向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀

D．将与酵母混匀的海藻酸钠溶液注入CaCl2溶液中，会观察到CaCl2溶液中有球形的凝胶珠形成

8．用固定化酵母细胞发酵葡萄糖溶液时，为了能产生酒精，下列措施错误的是（ ）

A．向瓶内泵入氧气 B．应将装置放于适宜的条件下进行

C．瓶内应富含葡萄糖等底物 D．将瓶口密封，效果更好

9.下列属于固定化酶在利用时的特点的是 （ ）

A．有利于酶与产物分离 B．制成的加酶洗衣服可以被反复利用

C．能自由出入依附的载体 D．能催化一系列的酶促反应

10．关于固定化酶技术说法正确的是 （ ）

A．固定化酶技术就是固定反应物，将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术

B．固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应

C．固定化酶中的酶无法重复利用

D．固定化酶是将酶固定在一定空间内的技术

11．研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的。如将从大肠杆菌得到的磷酸二酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的 （ ）

A．温度 B．pH C．水分 D．营养

12.使用固定化细胞的优点是( )

A.能催化大分子物质的水解 B．可催化一系列化学反应

C．与反应物易接近 D．有利于酶在细胞外发挥作用

13.酶的固定方法不包括( )

A.将酶吸附在固体表面 B．将酶相互连接起来

C．将酶包埋在细微网格里 D． 将酶制成固体酶制剂，如加酶洗衣粉中的酶

14.下列关于酶制剂的叙述错误的是( )。

A． 酶制剂是包含酶的制品 B．包内酶和包外酶均可用于制成酶制品

C．酶制品的生产包括酶的生产、提取、分离纯化和固定化等

D．固定化细胞不属于酶制剂

15.如果反应物是大分子物质，采用那种方法催化受限制( )。

A．直接使用酶 B．使用化学方法结合的酶

C．使用固定化细胞 D．使用物理吸附法固定的酶

16.下列关于酶和细胞的固定叙述不正确的是( )。

A． 酶分子很小，易采用包埋法 B．酶分子很小，易采用化学结合或物理吸附法固定的酶

C．细胞个大，难被吸附或结合 D．细胞易采用包埋法固定

17. 关于固定化酶的叙述不正确的是 ( )。

A． 既能与反应物接触，又能与产物分离 B．固定在载体上的酶可被反复利用

C．可催化一系列反应 D．酶的活性和稳定性受到限制

18.固定化细胞对酶的活性影响最小，根本原因是( )。

A．避免了细胞破碎、酶的提取纯化过程

B．固定化细胞在多种酶促反应中连续发挥作用

C．促化反应结束后，能被吸收和重复利用

D．细胞结构保证了各种酶在细胞内化学反应中有效的发挥作用

19.关于酵母细胞活化的说法，不正确的是( )。

A．酵母细胞活化就是由无氧呼吸变成有氧呼吸

B．活化就是让处于休眠状态的细胞恢复生活状态

C．酵母细胞活化所需要的时间较短 D．酵母细胞活化后体积增大

20.下列关于酶的叙述中正确的是( )。

A． 酶都提取于动植物细胞 B．酶制剂能够重复利用

C．果酒和果汁能够用酶制剂澄清 D．酶固定后称为酶制剂

21.对配制海藻酸钠溶液的叙述不准确的是( )。

A．加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环 B.海藻酸钠的浓度涉及固定化细胞的质量

C．海藻酸钠的浓度过高，易形成凝胶珠 D．海藻酸钠的浓度过低，形成凝胶珠内包埋细胞过少

22．目前，日用化工厂大量生产的酶制剂，其中的酶大都来自（ ）

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固定化技术应用-酶和细胞的固定化

固定化技术应用-酶和细胞的固定化

固定化技术应用－酶和细胞的固定化

试题中出现固定酶能不能催化一系列反应，查找资料，没有权威资料认为已经存在催化系列反应的酶，应该是研究方向。

选修知识的考查已经出现应用方向，也拓展到了技术的前景。也就是说，需要在教学中创设情境适当扩大知识面，结合试题进行教学会收到很好的效果，如固定化酶技术可以拓展到固定化细胞。

问题：固定化技术以及发展前景如何？什么是固定化酶？什么是固定化细胞？

01

1.固定化酶技术

固定化酶技术是用物理或化学手段。将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。

酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。

2.固定化酶技术的发展

以前，固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。

1916年Nelson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。科学家们就开始了同定化酶的研究工作。

1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L－氮基酸，开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。

我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究 。

当今，固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。

邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附－交联法，制备出具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶(MIE) 一方面由于载体具有两亲性，MIE可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；另一方面，由于载体具有磁响应性，MIE又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。

Puleo等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。

高中生物-酶的应用

高中生物-酶的应用

高中生物-酶的应用

考点二 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

1.固定化酶的概念和方法

(1)概念：将水溶性的酶用 物理或者化学 的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

(2)方法：吸附法、 共价偶联法 、交联法和包埋法等。

2. α-淀粉酶的固定化、淀粉水解的测定实验

(1)α-淀粉酶的固定化原理

①α-淀粉酶作用的最适条件：最适pH为 5.5～7.5 ，最适温度为 50～75 。

②方法 吸附法 。

③介质：石英砂。

(2)淀粉水解的检测原理

淀粉――――→α-淀粉酶 糊精 ――――→β-淀粉酶 麦芽糖 ―――――→糖化淀粉酶葡萄糖

遇碘显蓝色 遇碘显红色 遇碘不显色

(3)实验过程

固定化α-淀粉酶，装入注射器中

↓

以0.3 mL/min的流速滴加淀粉溶液过柱

↓

流出5 mL淀粉溶液后接收0.5 mL流出液

↓

滴加 KI-I2 溶液，观察颜色，用水稀释1倍后再观察颜色

↓

以10倍柱体积的蒸馏水洗涤固定化柱，放置在4 ℃冰箱中，几天后重复实验

(4)实验结果

对照组 实验组

0.5 mL淀粉溶液 0.5 mL流出液 几天后重复实验中0.5 mL流出液

加KI－I2 蓝色 红色 红色

再加水稀释1倍 浅蓝色 浅红色 浅红色

(5)实验结论：固定化α-淀粉酶能将淀粉水解成 糊精

(1)枯草杆菌的α-淀粉酶作用的最适温度为37 ℃( F )

(2)酶作为催化剂，反应前后结构不改变，所以固定化酶可永远使用下去(F )

(3)固定化酶可以反复利用，降低生产成本，提高产量和质量( T )

(4)固定化酶由于被固定在载体上，所以丧失了酶的高效性和专一性的特点( F )

固定化酶

固定化酶

固定化酶的制备及应用

摘要：本文主要从酶的固定化载体、固定化方法等方面介绍了固定化酶制备中的研究进展情况，并且从医药、食品、环保、等方面其在其中的新应用出发，对固定化酶在新领域中的应用作了综述，给固定化酶研究的发展前景进行了展望，并且指出了今后酶固定化研究的主要方向是多酶的固定化及制备高活性、高负载、高稳定性的固定化酶。

固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项技术。以往用的酶绝大多数是水溶性性的酶。这些水溶性的酶催花结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。60年代后，在美学研究领域内涌现出固定化酶，最早被称为“水不容酶”或“固相酶”，此技术将水不溶性的自然酶与不溶性载体相结合，成为不溶于水的酶的衍生物。固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。

利用固定化技术，解决了酶应用过程中的很多问题，为酶的应用开辟了新的前景。如可使所使用的酶、细胞能反复使用，使产物分离提取容易，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化，故在20世纪70年代后得到迅速发展 。其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新技术。

1固定化酶的优缺点

1.1 优点

（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用 ； （2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤 ；

（3）稳定性显著提高 ；

（4）可长期使用 ，并可预测衰变的速度；

（5）提供了研究酶动力学的良好模型。

（6）酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保证，成本低。

1.2缺点

（1）酶固定化时酶的活力有所损失，同时也增加了固定化的成本。

（2）比较适应水溶性底物和小分子底物。

（3）不适于多酶反应，特别是需要辅酶的反应。

2.固定化酶的制备原则

（1 ）必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。 这就要求酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，应避免活性中心的氨基酸残基参与固定化反应；另外，由于酶蛋白的高级结构是凭借疏水键、氢键、盐键等较弱的键维持的，所以固定化时应采取尽可能温和的条件，避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件，如高温、强酸、强碱、有机溶剂等处理。

固定化酶的方法和应用

固定化酶的方法和应用

固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶催化系统的过程。通过固定化，可使酶的活性和稳定性得到提高，并能够重复使用。常用的固定化酶方法包括吸附法、共价连接法、包埋法和交联法等。

1. 吸附法：利用载体表面与酶相互吸附的原理将酶固定在载体表面。常用的载体包括硅胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。

2. 共价连接法：通过将酶分子与载体分子之间的化学键共价连接，在载体表面上固定酶。常用的共价连接剂包括辛二酸二酐、戊二酸二酐等。

3. 包埋法：将酶包裹在聚合物中，在聚合物内部形成微观环境，保护酶免受外界环境的影响。常用的包埋材料包括明胶、蛋白质和聚乙烯醇等。

4. 交联法：将酶和载体分子之间形成交联结构，将酶牢固地固定在载体表面上。常用的交联剂包括戊二醛、葡萄糖等。

固定化酶在生物技术、食品工业、医药工业等领域有着广泛的应用。其中，利用固定化酶在生物技术领域中最为突出。例如，固定化酶可以应用于产生大量纯度高的特定酶，用于DNA重组、制备抗体和识别特定分子等。此外，在医药工业中也广泛使用固定化酶，如利用固定化酶制备药物、检测生物标志物等方面。在食品工业中，固定化酶可用于生产乳制品、果汁、啤酒等食品中。

总之，固定化酶是一种重要的生物技术手段，具有广泛应用前景，可推动生物技术、食品工业、医药工业等领域的发展。