HER2靶向重组截短型Bid片段融合蛋白对骨肉瘤细胞的促凋亡作用

・１２０・　

第２０卷第２期　

２００７年２月　医学研究生学报　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｓ　Ｖｏｌ＿２０　Ｎｏ．２　

Ｆｅｂ．２００７　

・论　著・　

ＨＥＲ２靶向重组截短型Ｂｉｄ片段融合蛋白对　

骨肉瘤细胞的促凋亡作用　

纪振钢　，　裘秀春　，　杨彤涛　，　龙华　，　马保安　，　

周　勇　，　张明华　，　许彦鸣　，　杨安钢　，　范清宇　

（１．第四军医大学唐都医院骨科中心，陕西西安７１００３８；２．第四军区大学生物化学与分子生物学　

教研室，陕西西安７１００３２；３．第四军区大学免疫学教研室，陕西西安７１００３２）　

摘要：　目的：观察人上皮细胞生长因子受体２（ＨＥＲ２）靶向重组的活性截短型Ｂｉｄ（ｔＢｉｄ）融合蛋白对骨肉瘤　ＳＯＳＰ－９６０７细胞的促凋亡作用。　方法：将抗ＨＥＲ２单链抗体基因ｅ２３ｓＦｖ、与绿脓杆菌外毒素（ＰＥ）的转膜结构域　基因（Ｐ删）和ｔｂｉｄ基因连接，构建成ｉｍｍｕｎｏ—ｔｂｉｄ（ｅ２３　ｓＦｖ—ＰＥｌｌ－ｔｂｉｄ）基因，将其克隆人真核表达载体ｐＣＭＶ中，转　染ＳＯＳＰ－９６０７细胞，间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化，通过Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ染色、流式细胞仪检测　观察其促凋亡作用。　结果：转染ＳＯＳＰ一９６０７细胞后，间接免疫荧光染色检测出ｔＢｉｄ的表达．ＳＯＳＰ－９６０７细胞出　现明显的固缩，核浓缩等凋亡特征。Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ染色、流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞，凋亡率为４２％，对照　组细胞仅６％，表明细胞膜表面有磷脂酰丝氨酸外翻，提示重组ｉｍｍｕｎｏ—ｔｂｉｄ基因表达后有促凋亡作用。　结论：　重组ｉｍｍｕｎｏ—ｔｂｉｄ基因可在转染的ＳＯＳＰ－９６０７细胞中表达，并诱导其细胞凋亡。　关键词：　截短型Ｂｉｄ片段；人上皮细胞生长因子受体２；融合蛋白；　骨肉瘤ＳＯＳＰ－９６０７细胞；细胞凋亡　中图分类号：　Ｒ７３８．７　文献标识码：　Ａ　文章编号：　１００８—８１９９（２００７）０２－０１２０－０３　

Ｔｈｅ　ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＨＥＲ２　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　Ｂｉｄ　ｆｕｓｉｏｎ　

ｐｒｏｔｅｉｎ　０１１　ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　

ＪＩ　Ｚｈｅｎ—ｇａｎｇ　，ＱＩＵ　Ｘｉｕ—ｃｈｕｎ　，ＹＡＮＧ　Ｔｏｎｇ—ｔａｏ。，ＬＯＮＧ　Ｈｕａ　，ＭＡ　Ｂａｏ．ａｎ　，ＺＨＯＵ　Ｙｏｎｇ　，　

ＺＨＡＮＧ　Ｍｉｎｇ—ｈｕａ　，ＸＵ　Ｙａｎ—ｍｉｎｇ　，ＹＡＮＧ　Ａｎ—ｇａｎｇ　，ＦＡＮ　Ｑｉｎｇ—ｙｕ　

（１．Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｓ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｔａｎｇｄｕ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，￡胁Ｆｏｕｒｔｈ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　

７１０ｏ３８，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．￡胁Ｆｏｕｒｔｈ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１００３２，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ；　３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，￡胁Ｆｏｕｒｔｈ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　

Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１００３２，Ｓｈ００ｎ　，Ｃｈｉｎ０）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏ—ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＨＥＲ２　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｔｒｕｃａｔｅｄ　

ＢＨ３　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｄｅａｔｈ　ａｇｏｎｉｓｔ（ｔＢｉｄ）ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｎ　ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ　ＳＯＳＰ－９６０７　ｃｅｌｌｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｉｍ．　

ｍｕｒｌｏ－ｔｂｉｄ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ　ｆｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ａ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ．ａ　ｓｉｎｇｌｅ．　ｃｈａｉｎ　ＨＥＲ２　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｅ２３ｓＦｖ），ａ　ＰＥ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ（ＰＥ　ａａ２５３—３６４）ａｎｄ　ｔＢｉｄ，ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏ．　

收稿日期：　基金项目：　

作者简介：　通讯作者：　２００６－０９－０３；修订日期：２００６．１０－１７　国家自然科学基金资助项目（批准号：３０３３０６１０）；国家自然科学基金资助项目（批准号：３０４７１９８８）；中国博士后基金资　助项目（批准号：２００５０３８２５９）　纪振钢（１９７４一），男，辽宁辽阳人，主治医师，医学硕士研究生，从事骨科专业。　范清宇（１９４１・），男，河南上蔡人，主任医师，医学博士，博士生导师，从事骨肿瘤基础专业。

　维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期　纪振钢，等ＨＥＲ２靶向重组截短型Ｂｉｄ片段融合蛋白对骨肉瘤细胞的促凋亡作用　・１２１・　

ｔｂｉｄ　ｇｅｎｅｓ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ａ　ｐＣＭＶ　ｐｌａｓｍｉｄ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ＳＯＳＰ－９６０７　ｃｅｌｌｓ．　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅ—　

ｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｉｍｍｕｎ０一ｔｂｉｄ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ＳＯＳＰ－９６０７　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏ—　

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ—ＦＩＴＣ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｉｎ—　

ｄｕｃｅｄ　ｂｖ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｔＢｉｄ　ｇｅｎｅｓ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｔＢｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｅｘ—　

Ｄｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ＳＯＳＰ－９６０７　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｍｍｕｎｏ—ｔｂｉｄ　ｇｅｎｅｓ，ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｃｅｌｌ　ｓｈｒｉｎｋａｇｅ　ａｎｄ　

ｎｕｃｌｅａｒ　ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ．Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ—ＦＩＴＣ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　

ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏ—ｔｂｉｄ　ｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　４２％，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　６％ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｃｅｌｌｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｏ—　

ｓｕｒｅ　ｏｆ　Ｄｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｕｔｅｒ　ｌｅａｆｌｅｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＨＥＲ２　ｔａｒｇｅｔｅｄ　

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｔＢｉｄ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃａｎ　ｉｎｄｕｃｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＳＯＳＰ－９６０７　ｃｅｌｌｓ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ＢＨ３　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｄｅａｔｈ　ａｇｏｎｉｓｔ；Ｈｕｍａｎ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２；　

Ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ；　Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ　ＳＯＳＰ－９６０７　ｃｅｌｌ；　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　

０引　言　

Ｂｉｄ（ＢＨ３　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｄｅａｔｈ　ａｇｏｎｉｓｔ）是一个只含　

ＢＨ３结构域的促凋亡Ｂｃｌ－２家族成员。通常情况　

下，Ｂｉｄ分子定位于细胞质中，并不表现其促凋亡活　

性。当受凋亡信号刺激后，能被天冬氨酸特异性半　

胱氨酸蛋白酶－８（ｃａｓｐａｓｅ－８）、粒酶（ｇｒａｎｚｙｍｅ　Ｂ）、钙　

激活中性蛋白酶（ｃａｌｐａｉｎｓ）和组织蛋白酶（ｃａｔｈｅｐ—　

ｓｉｎｓ）等多种蛋白酶剪切活化，去除Ｎ末端后，截短　

型Ｂｉｄ片段（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　Ｂｉｄ，ｔＢｉｄ）从细胞质转位至线　

粒体，使线粒体通透性改变，释放细胞色素Ｃ和其　他促凋亡分子以调节细胞凋亡ｌ】　Ｊ。骨肉瘤是儿童　

和青少年最常见的骨原发性恶性肿瘤。有４０％～　

４５％的成骨肉瘤及５８％的成骨肉瘤肺转移癌　

存在人上皮细胞生长因子受体２（ｈｕｍａｎ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　

ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２，ＨＥＲ２）特异性高表达。　

ＨＥＲ２表达量越高，肿瘤的恶性程度越高，患者预后　

也越差　。本研究中所构建的重组促凋亡分子是　

以ＨＥＲ２为靶点，旨在研究该重组蛋白对骨肉瘤　

ＳＯＳＰ－９６０７细胞的促凋亡作用，探索其在骨肉瘤治　

疗中的应用前景。　

１材料和方法　

１．１材料和试剂ＤＨ５ｄ感受态细菌、ｐＣＭＶ空载　

体、ｐＣＭＶ－ｉｍｍｕｎｏ－ＡＩＦ质粒　Ｊ、ｐｃＤＮＡ３一Ｂｉｄ质　

粒［１　、人骨肉瘤细胞系ＳＯＳＰ．９６０７由本室保存。　

ＲＰＭＩ　１６４０培养液、脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ＴＭ、新　

生牛血清均购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。山羊抗人ｔＢｉｄ多　

克隆抗体、鼠抗人ＨＥＲ２单克隆抗体、Ｉｓｏｔｙｐｅ为Ｓａｎ．　

ｔａ　Ｃｒｕｚ公司产品；异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记的　

兔抗山羊ＩｇＧ、４　６．二月米基－２．苯基吲哚（ＤＡＰＩ）为　

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ公司产品；限制性核酸内切酶　

Ｘｂａ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉ、Ｎｏｔ　Ｉ和Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ均购自　ＴａＫａＲａ公司。　

１．２　方法　

１．２．１　细胞转染将处于对数生长期的ＳＯＳＰ－９６０７　

细胞用２．５　ｇ／Ｌ胰蛋白酶消化后，以１×１０。／孔接种　

于６孔板中，继续培养２４　ｈ。待８０％以上细胞贴壁　

后，吸出培养液，用ＲＰＭＩ　１６４０将细胞冲洗２次。取　

３　ｇ／孔的ｐＣＭＶ．５—２和ｐＣＭＶ空载体分别溶于　

５００Ｉｘｌ　ＲＰＭＩ　１６４０培养液，称为Ａ１、Ａ２液；将２份　

６　ｌ／，孔的Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００　各溶于５００　Ｉｘｌ　ＲＰＭＩ　

１６４０培养液中，室温下孵育５　ｍｉｎ，为Ｂ１、Ｂ２液；将　

Ａ１、Ｂ１，Ａ２、Ｂ２两液分别混合，轻轻摇动，室温孵育　

２０　ｍｉｎ，缓缓滴加至洗过的细胞中，于３７℃、５０　ｍｌ／Ｌ、　

ＣＯ　条件下培养６　ｈ。吸弃转染液，加人１　ｍｌ含２００　

ｍｌ／，Ｌ小牛血清的无抗生素ＲＰＭＩ　１６４０培养液中，继　

续培养。　

１．２．２　间接免疫荧光染色和流式细胞术（ＦＣＭ）分析　

制备细胞爬片，经转染４８　ｈ后，以４０　ｇ／Ｌ多聚甲醛　

固定３０ｍｉｎ，０．１　ｍＬ／Ｌ聚乙二醇辛基苯基醚（Ｔｒｉｔｏｎ）　

Ｘ－１００处理，３０　ｍＬ／Ｌ　Ｈ　Ｏ　灭活内源性过氧化物酶，再　

以正常山羊血清进行封闭。依次加入一抗、ＦＩＴＣ标　

记的二抗和ＤＡＰＩ，以荧光显微镜观察并照相或制备　

好的细胞悬液经上述染色后用ＦＣＭ分析。　

１．２．３标记异硫氰酸荧光素的钙依赖磷脂结合蛋　

白（Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＦＩＴＣ）染色用ｐＣＭＶ－５．２（实验组）　

及空载体ｐＣＭＶ（对照组）转染ＳＯＳＰ－９６０７细胞，并　

收集转染后４８　ｈ的细胞，ＰＢＳ洗涤后进行Ａｎｎｅｘｉｎ