纳米材料在骨、牙再生修复中的生物学过程研究
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项目名称： 纳米材料在骨、牙再生修复中的生物学过程研究
首席科学家： 林野 北京大学
起止年限： 2012.1至2016.8
依托部门： 教育部
一、关键科学问题及研究内容
（一）关键科学问题
对植入式生物材料纳米结构与机体反应的调控机理与作用机制进行深入研究和认识，将有助于解决纳米生物医用材料发展面临的重大科学问题,发展具有我国自主知识产权的纳米生物医用材料，提高硬组织重大疾病诊疗水平奠定基础，满足我国社会经济和人民健康事业发展的重大需求。围绕上述国家重大需求，针对硬组织再生修复需要解决的重大科学问题，本项目拟设立4个课题，课题之间形成有机联系，通过联动与协作，重点解决以下共性关键科学问题：
(1) 具有高生物相容性纳米材料及其界面的设计与制备原理；
(2) 材料表面纳米结构与细胞、组织之间的相互作用机理；
(3) 纳米结构对材料/组织界面生物力学匹配性、植入体长期力学稳定性、植入体寿命的影响机制；
(4) 纳米生物医用材料、材料/组织界面表征新手段、新方法
（二）结合科学问题的内涵将开展的主要研究内容
钛合金种植体材料表面纳米拓扑结构的结构梯度和成分梯度都会影响种植体材料与细胞的相互作用，因此本研究将定量研究不同表面纳米功能梯度的新型钛合金种植体材料对骨整合相关蛋白质组变化，对成骨细胞增殖分化、破骨细胞前体转化以及成纤维细胞信号通路系列基因表达的影响，探索材料表面纳米功能梯度结构设计对骨整合界面结合特性、细胞选择过程及相关信号因子的影响规律，探讨材料表面拓扑结构对成骨的控制作用，为表面纳米功能梯度的新型钛合金牙种植体材料的设计、制备和调控提供科学理论依据。
利用高分子（如聚酰胺PA）优异的生物相容性及与颌骨松质骨极其接近的弹性模量以及其吸湿后微小的体积膨胀等特点，设计功能梯度涂层来调整PA涂层与钛基体间热膨胀系数，采用塑料火焰喷塑技术在蚀刻处理后的纯钛种植体表面形成一层类牙周膜功能的成分过渡的TiO2/TiO2-PA/PA高分子涂层，探讨其应力缓冲和传导特性，揭示其在结构和功能方面与天然牙周膜间的关联及相似性，
探索其模仿天然牙周膜行使功能的基础及其与周围组织间生物力学相容的机制，并利用蛋白质组学技术，从蛋白质分子水平，研究材料及表面仿生设计。
牙齿硬组织仿生再生修复过程中再生层与牙体组织界面结合强度直接影响修复的长期效果与稳定。本项目将从纳米尺度/蛋白质组水平探索纳米材料在牙齿硬组织生物矿化过程中分子作用机制，合理设计和制造更加适合口腔环境临床操作的牙釉质、牙本质原位再生修复的纳米材料配方，建立基于纳米材料的牙釉质、牙本质再生修复的新工艺及新理论，实现材料与牙齿硬组织中胶原蛋白和无机盐形成多位点化学结合，解决界面结合的力学匹配性，赋予再生修复层长期力学稳定性，延长再生修复层的寿命。
通过对纳米结构微环境特征对成骨相关细胞（主要是BMSCs）功能和分化调控的分子机制进行深入研究，建立材料特性与BMSCs定向分化之间的关联，将利于获得对颌骨组织再生重建机制的定量认识。本研究针对口腔颌骨修复要求，拟开展微环境特征——基因表达变化规律——与成骨分化相关指标相互关系的研究，以检测BMSCs成骨分化过程全基因组差异表达为基础，分析成骨分化信号通路，研究BMSCs在各种微环境下的成骨诱导分化，探索纳米结构特征对BMSCs成骨分化调控的机制，将更好地促进颌骨缺损组织修复并完成其功能重建，并配合牙种植体修复实现第三代口腔功能修复材料从学术研究到临床治疗应用的转变。
二、预期目标
（一）总体目标
本项目重点探讨仿生自组装及植入式口腔生物材料表面纳米结构对宿主反应的调控机理，阐明纳米材料与口腔牙、骨硬组织之间相互作用的生物学过程，为实现颌骨和牙齿再生修复过程中材料/组织界面的快速生物愈合和长期生物力学相容提供新的思路和理论依据。阐明钛种植体表面纳米拓扑结构对细胞生长和相关信号通路的调控机制，实现种植体-骨组织界面有效结合的再生设计，促进种植体界面的快速骨整合；揭示钛种植体表面低弹性模量纳米复合涂层模仿天然牙周膜行使功能的基础，实现种植体的长期稳定性；明确类牙釉质、类牙本质再生层与牙体组织的界面结合机制及相关物理、化学、力学及生物性能；建立基于纳米材料的牙釉质、牙本质再生修复的新工艺及新理论；阐明纳米尺度材料微环境特征调控成骨相关细胞生物学行为的分子机制，在细胞/修复材料复合物植入体介导的颌骨组织再生机制理论认识方面取得突破。通过项目研究和国际合作与交流，产生重要创新性理论和实用成果，培养一批青年学科骨干人才，并吸引留学博士、博士后回国工作。
（二）五年预期目标
(1) 构建功能梯度的新型钛合金种植体，系统研究材料表面纳米化技术序列处理所形成的纳米梯度结构，及该梯度结构与组织有效结合机制和技术，从纳米尺度/蛋白质组/基因水平，探索种植体表面拓扑结构对细胞生长和相关信号通路的控制机制，获得具有多孔梯度结构新型钛合金牙种植体材料成分设计和纳米结构控制方法。
(2) 构建钛种植体表面获得与牙周骨组织匹配的低弹性模量功能梯度高分子涂层，探讨其应力缓冲和传导特性，揭示其在结构和功能方面与天然牙周膜间的关联及相似性，探索其模仿天然牙周膜行使功能的基础及其与周围组织间生物力学相容的机制。获得具有适宜弹性模量的牙种植体成分设计和纳米结构控制方法。
(3) 实现基于纳米材料自组装技术的牙釉质、牙本质原位再生；阐明类牙釉质结
构、类牙本质结构的生长和组装机制，揭示基于生物矿化原理纳米羟磷灰石晶体可控有序生长、自组装的规律；合理设计和制造更加适合口腔环境临床操作的牙釉质、牙本质原位再生修复的纳米材料配方，提出并验证牙釉质、牙本质原位再生修复的临床可行应用方案。
(4) 通过仿生技术、纳米技术、多相复合、多级结构构建、表面功能化和微图案化等多项技术复合，获得具有仿生纳米结构的新型功能化颌骨修复材料；建立颌骨修复材料制备工艺参数——纳米结构——细胞行为的定量关联，揭示具有仿生结构支架材料与成骨相关细胞相互作用实质；阐明纳米结构微环境特征调控成骨相关细胞生物学行为的分子机制，在细胞/修复材料以及颌骨修复材料与牙种植体复合植入过程中颌骨组织再生重建机制方面取得突破；
(5) 通过本项目研究，将开发出3-4种新型口腔纳米生物医用材料；在国内外申请发明专利15-20项；发表SCI论文30-50篇，培养博士、硕士研究生50人以上；承办或主持召开国际学术会议2-3次；通过与国外研究机构开展合作与人员交流，培养青年学科骨干人才16人以上。
三、研究方案
（一）总体研究思路
开发功能梯度的新型钛合金材料，其弹性模量与不同部位的种植体-组织界面生物力学相适宜，系统研究材料表面纳米化技术序列处理所形成的纳米多孔梯度结构，及该梯度结构与组织有效结合技术，通过细胞和动物实验探索种植体表面纳米形貌与组织界面结合特性、对细胞选择过程及相关信号因子的影响规律，探索出种植体表面拓扑结构对细胞生长和相关信号通路的控制机制，实现种植体-骨组织界面有效结合的再生设计，获得牙种植体表面纳米化设计和纳米结构控制方法。
制备纯钛种植体表面TiO2/TiO2-PA/PA功能梯度涂层，考察喷塑工艺条件、原料组分比例、涂层厚度等对涂层形貌、弹性模量及附着强度的影响。并通过化学沉积法在表面定向生长HA晶体，提高PA涂层表面生物活性，考察沉积液浓度、沉积时间、沉积温度、溶液pH值等因素对HA晶体形貌、生成量、晶体生长方向、结晶度以及在PA涂层中沉积深度的影响，探讨HA晶体生长机制。并通过掺杂锶、镁、锌等微量元素替代HA中部分钙离子，以提高PA涂层的表面生物活性，加速种植体与颌骨间的骨整合。通过体外细胞与动物体内实验，对表面有纳米功能梯度涂层的种植体生物学行为进行系列研究，观察种植材料对成骨细胞、骨髓基质干细胞增殖分化能力的影响，并用定量组织学、生物力学与Micro-CT等分析手段研究种植体植入正常与骨质疏松动物模型后的骨整合能力与机械稳定性。
运用量化计算和分子设计的方法，通过模拟牙釉质、牙本质生物矿化机制，研究纳米羟磷灰石晶体成核、生长及自组装的规律。探讨釉原蛋白、釉蛋白、釉丛蛋白等对牙釉质矿化的影响；探讨牙本质涎蛋白、牙本质磷蛋白等非胶原蛋白对牙本质矿化的影响；考察多肽及非多肽分子对纳米羟磷灰石晶体生长及自组装的控制；阐明牙釉质和牙本质的生物矿化机制；重点分析类牙釉质、类牙本质再生层与牙体组织的界面结合机制及相关物理、化学、力学及生物性能；合理设计和制造更加适合口腔环境临床操作的牙釉质、牙本质原位再生修复的纳米材料配方，提出并验证牙釉质、牙本质原位再生修复的临床可行应用方案，优化并建立基于纳米材料的牙釉质、牙本质再生修复的新工艺及新理论。
以脂肪族聚酯和聚酰胺为主要合成高分子，以胶原和明胶为主要天然高分子，以纳米HA等为主要无机成分，以静电纺丝为主要纳米纤维成型技术，结合表面改性、多相成分复合、多级结构建构、生长因子控释技术的研究和复合，获得在多个纳米结构特征（如本体和表面化学组成、形貌、拓扑学结构）存在显著差异的系列仿生纳米结构人工细胞外基质。应用基因工程（基因芯片和iRNA）技术，结合分子生物学手段，基于对整合素受体基因表达以及Wnt/β-catenin、MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）和TGF-β/BMPs等成骨分化信号通路的研究结果，阐明微环境特征调控成骨相关细胞生物学行为的分子机制，对比研究体内外诱导和促进骨组织再生及整体血管化情况，评价颌骨修复和功能重建的效果，认识细胞/修复材料复合物植入体介导的骨组织再生机制。
（二）技术路线与可行性
1. 牙科种植体表面纳米化促进骨整合的机理研究
技术路线：
(1) 研究表面纳米功能梯度的新型钛合金牙种植体材料制备技术：
1) 新型钛合金种植体基材制备：
选用高强度低模量多功能钛合金，通过合金熔炼、高温锻造、中温精锻和中温轧制工艺制备牙种植体所需的棒材，研究中温变形的组织演化过程及其对生物力学性能的影响，优化材料的性能，为后续表面纳米化处理提供高韧性棒材。
2) 新型钛合金纳米结构表面构建：
综合运用塑性变形法、化学处理、水热处理、微弧氧化等方法构建新型钛合金纳米结构表面，表征不同工艺条件下获得的纳米材料的显微组织结构特征包括表面成分及形貌、物相结构、元素化学态等以及物理化学性能。揭示表面纳米化处理工艺对钛合金表面组织结构、物理化学性能、磷灰石诱导性能等的影响规律，阐明在不同处理方式下，钛合金表面纳米化的过程及其机制，优选合适的表面纳米化处理工艺。
(2) 研究表面纳米功能梯度的新型钛合金牙种植体-骨组织界面结合机制:
1) 表面纳米功能梯度的新型钛合金牙种植体材料对破骨细胞（osteoclast cell,
OC）、成骨细胞（osteoblast cell, OB）生物学行为，以及对破骨细胞-成骨细胞间信号转导影响的研究：
