大孔树脂对大青叶有机酸的纯化工艺研究摘要:通过静态和动态相结合的方法,以邻氨基苯甲酸的吸附率､解吸率为指标,优化大孔树脂纯化大青叶提取液中有机酸的工艺参数｡结果表明,大孔树脂X-5对邻氨基苯甲酸的吸附为快速平衡型,适宜的吸附条件为大青叶提取液上样浓度0.18 mg/mL,静态吸附时间3 h,pH 4;体积分数65%的乙醇作洗脱剂洗脱效果较好｡关键词:大青叶(Folium Isatidis);邻氨基苯甲酸;大孔吸附树脂;静态吸附;动态吸附Study on Purification Technology of Organic Acids from Folium Isatidis by Macroporous ResinsAbstract: The purification conditions of anthranilic acid from Folium Isatidis extract were optimized by the combination of static and dynamic method, with the adsorption rate and desorption rate of anthranilic acid as indicators. The results showed that the adsorption and desorption of X-5 resin belonged to the fast balanced model. The optimum adsorption techniques were concentration of Folium Isatidis extract, 0.18 mg/mL; adsorption time, 3 h; pH 4. Good desorption effiecient could be obtained if using 65% ethanol solution(volume fraction) as eluent.Key words: Folium Isatidis; anthranilic acid; macroporous resin; static adsorption; dynamic adsorption大青叶(Folium Isatidis)为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥叶,其味苦性寒,归心､胃经,主要功能是清热解毒､凉血消斑,用于温邪入营､高热神昏､发斑发疹､黄疸､热痢､痄腮､喉痹､丹毒､痈肿[1]｡靛蓝和靛玉红历来被认为是大青叶的主要药效成分[2],但也有研究表明,有机酸可能是大青叶抗炎解热的有效成分之一[3],其中邻氨基苯甲酸含量最高,占总酸含量的70%以上,可作为药材评价的指标[4]｡大孔吸附树脂具有理化稳定性高､吸附选择性强､富集效果好､解吸条件温和､再生简单､使用周期长､提取工艺简便､有机溶媒的耗用少､分离效率高､分离得到的有效成分纯度高等优点,近十年来被广泛用于药材有效成分的分离提取[5]｡本研究选取7种大孔吸附树脂,比较其对邻氨基苯甲酸的吸附率､解吸率及动力学特性,从中筛选出合适的树脂,对其静态吸附进行系统研究分析,并结合动态吸附优化有机酸的纯化工艺条件,为大青叶有机酸的工业化生产提供一定的参考｡1 材料与方法1.1 材料与试剂大青叶(产地甘肃,批号:20101001);乙腈(天津化学试剂有限公司),0.5%磷酸(天津化学试剂有限公司),邻氨基苯甲酸对照品(兰州中科凯特科工贸有限公司);大孔树脂D101､HPD400､S-8､AB-8､X-5､SP8-25､NKA-9(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)｡1.2 主要仪器高效液相色谱仪,美国Waters e2695;DFT-250手提式高速万能粉碎机,温岭市林大机械有限公司;KH-300DB型数控超声清洗器,昆山禾创超声仪器有限公司;SHA-B水浴恒温振荡器,常州国华电器有限公司;旋转蒸发仪,巩义市予华仪器有限责任公司;Pine-tree纯水机,北京湘顺源科技有限公司｡1.3 实验方法1.3.1 大青叶提取液的制备称取一定量大青叶,粉碎,用75%的乙醇(体积分数,下同)超声提取3次,每次40 min,过滤,旋转蒸发仪将乙醇挥发出,回收溶液,自然挥干,所得浸膏用30%的乙醇溶解,即为大青叶提取液,4 ℃冷藏备用｡1.3.2 大孔树脂的预处理将大孔树脂用无水乙醇浸泡24 h,使之充分溶胀,用无水乙醇洗至流出液与水混合不产生白色沉淀为止,用去离子水洗至无醇味;然后用50 mL/L HCl浸泡4 h,去离子水洗至中性;最后用20 mg/mL NaOH浸泡4 h,去离子水洗至中性,备用｡1.3.3 树脂含水量的测定实验中所用树脂为湿树脂,而考察树脂吸附和解吸需要以树脂干重为参照,故需要测定树脂含水量｡分别准确称取已经处理好的各种湿树脂3份适量,置110 ℃烘箱中烘至恒重,根据干燥前后树脂质量变化计算树脂含水量[6]｡树脂的物理性质和含水量如表1｡1.3.4 大孔树脂对邻氨基苯甲酸的静态吸附与解吸称取预处理好的大孔吸附树脂1 g(湿重,下同)置于100 mL具塞锥形瓶中,精确加入一定浓度和pH的大青叶有机酸提取液20 mL,130 r/min､25 ℃恒温水浴振荡12 h,使树脂充分吸附;吸附结束后减压过滤除去残留液,加入50 mL 80%的乙醇,130 r/min､25 ℃恒温水浴振荡12 h,进行有机酸的解吸｡分别测定各树脂吸附前与解吸后溶液中邻氨基苯甲酸的浓度,根据式(1)､式(2)计算各树脂对邻氨基苯甲酸的吸附量(Qe)､解吸量(Qd);根据式(3)计算解吸率(E)｡吸附量Qe(mg/g)=(C0-Ce)×V1/W (1)解吸量Qd(mg/g)=C1V2/W (2)解吸率E(%)=C1V2/(C0-Ce)V1 (3)式中,C0为大青叶提取液中邻氨基苯甲酸的浓度(mg/mL),Ce为吸附平衡后溶液中邻氨基苯甲酸的浓度(mg/mL),V1为被吸附液体积(mL);V2为解吸液体积(mL);W为大孔吸附树脂干重(g);C1为解吸液中邻氨基苯甲酸的浓度(mg/mL)｡1.3.5 邻氨基苯甲酸的含量测定①色谱条件｡色谱柱为SunFireTM C18柱(5 μm,4.6 mm×150 mm),流动相为乙腈—0.5%的磷酸(体积比80∶20),检测波长254 nm,流速1 mL/min,进样量10 μL,柱温30 ℃｡②标准曲线的绘制｡取70 mg邻氨基苯甲酸置于250 mL容量瓶中,用甲醇溶解定容｡准确吸取储备液2.5､5.0､10.0､15.0､20.0､25.0 mL于50 mL容量瓶中,用甲醇定容,得浓度分别为0.014､0.028､0.056､0.084､0.112､0.140 mg/mL的系列标准溶液｡将标准溶液按由低到高的浓度梯度依次注入高效液相色谱仪中,按上述色谱条件测定｡以进样浓度X(mg/mL)为横坐标､峰面积Y为纵坐标进行线性回归,结果显示邻氨基苯甲酸对照品在0.014~0.140 mg/mL范围内浓度与峰面积呈现良好的线性关系,回归方程为Y=969 296X-699 056,r2=0.992 5｡2 结果与分析2.1 大孔吸附树脂的筛选大孔吸附树脂的吸附量大小与树脂的极性､空间结构(孔径､比表面积､孔容等)及被吸附物质的性质､分子结构､分子大小等有着重要的关系｡采用不同大孔树脂吸附邻氨基苯甲酸,吸附量､吸附率､解吸率如图1｡由图1可以看出,各种树脂对邻氨基苯甲酸均有吸附作用｡其中X-5､D101树脂对邻氨基苯甲酸的吸附量和解吸率均较高,NKA-9与SP8-25解吸率高但吸附量小｡综合考虑树脂的吸附量､解吸量和解吸率,选择X-5､D101和NKA-9 3种树脂用于后续实验｡2.2 树脂静态吸附动力学曲线吸附速度是树脂吸附性能的重要参考指标｡称取预处理的大孔树脂1 g,加入30 mL大青叶提取液,每隔1 h取样测定溶液中的邻氨基苯甲酸浓度,8 h内的树脂吸附动力学曲线如图2｡由图2可以看出,随着吸附时间的延长,树脂对邻氨基苯甲酸的吸附量先呈上升趋势,各种树脂吸附达到平衡的时间分别是X-5,3 h;D101和NKA-9,4~5 h｡树脂的吸附动力学特性与吸附效率密切相关,在有充分吸附时间的情况下,有些树脂可能具有相近的饱和吸附量,但是由于各树脂化学和物理结构的差别,其吸附动力学过程是有差异的｡X-5树脂对邻氨基苯甲酸具有较好的吸附动力学特性,可以较快地达到吸附平衡,更适于工业化生产｡2.3 提取液pH对吸附的影响称取预处理好的X-5型大孔吸附树脂1 g,置于100 mL具塞锥形瓶中,加入浓度相同､pH不同的大青叶提取液30 mL,130 r/min､25 ℃恒温水浴振荡12 h,比较pH 对树脂吸附量的影响,结果如图3｡pH为4时X-5型大孔吸附树脂对邻氨基苯甲酸的吸附量最大,表明此条件下邻氨基苯甲酸较多地保持了分子状态,易被大孔树脂吸附｡2.4 树脂静态吸附等温曲线在大孔吸附树脂中各吸附点以范德华力与游离分子相结合,由于吸附树脂的比表面积有限,吸附点有限;随着浓度增大,各吸附点逐渐被有机酸和杂质分子占据,树脂吸附容量逐渐趋向饱和,吸附率则随着提取液浓度的增加逐渐下降,因此等温吸附曲线可以反映被吸附物质与吸附树脂之间亲和力的信息｡配制浓度分别为0.06､0.09､0.12､0.15､0.18和0.21 mg/mL的大青叶提取液,使树脂达到吸附平衡后测定邻氨基苯甲酸浓度,得到X-5树脂于25 ℃时的等温吸附曲线如图4｡由图4可以看出,大青叶提取液浓度小于0.18 mg/mL时,树脂吸附量随着其浓度的增加而增加;当提取液浓度大于0.18 mg/mL时,树脂吸附量达到饱和｡2.5 大孔树脂的动态洗脱2.5.1 洗脱剂的选择将吸附完全的大孔树脂分成4份,每份1 g放入100 mL 锥形瓶中,分别加入甲醇､95%的乙醇､乙酸乙酯､丙酮各50 mL,130 r/min､25 ℃恒温水浴振荡4 h,测定其中邻氨基苯甲酸的浓度,结果见图5｡由图5可看出,甲醇的解吸能力最强,乙醇和丙酮次之｡但甲醇具有毒性,不适合大量使用;而乙醇价格便宜且无毒,因此选择乙醇作为洗脱剂｡2.5.2 洗脱剂浓度的选择称取10 g大孔树脂,经处理后湿法上柱,上样吸附,流速为2 BV/h｡蒸馏水快速冲洗,依次以10%､30%､65%､75%､95%的乙醇洗脱,流速2 BV/h,收集各浓度乙醇洗脱液,测定其邻氨基苯甲酸的含量｡结果表明,65%的乙醇洗脱效果最好,75%的乙醇洗脱液中邻氨基苯甲酸含量较低,其余均不含有｡2.5.3 泄露曲线取经处理的大孔树脂10 g湿法上柱,缓慢加入浓度为0.5 mg/mL的大青叶提取液,流速2 BV/h,收集流出液,每10 mL收集1次,测定邻氨基苯甲酸的浓度｡以流出液体积为横坐标､邻氨基苯甲酸浓度为纵坐标,绘制泄露曲线如图6｡从图6可以看出,当流出液体积大于50 mL时,流出液中邻氨基苯甲酸的浓度显著升高,表明此时邻氨基苯甲酸开始泄露,在此浓度下最大上样量是50 mL ｡3 小结与讨论大孔树脂具有选择性好､吸附容量大､解吸容易､可再生等优点,被广泛应用于天然产物的分离｡对于大青叶生物碱的研究已经很多,但有机酸研究还很缺乏｡通过静态吸附研究,得出非极性树脂X-5对大青叶有机酸吸附和解吸作用最好,达到吸附平衡的时间为3 h左右,适宜上样浓度为0.18 mg/mL,上样溶液最佳pH为4｡通过动态实验确定X-5大孔树脂最佳洗脱剂为体积分数65%的乙醇｡通过绘制泄露曲线发现大青叶提取液浓度为0.5 mg/mL时,上样体积超过50 mL则邻氨基苯甲酸开始泄露｡本研究为大青叶有机酸富集工艺的进一步研究提供了理论依据｡参考文献:[1] 中国药典编委会.中国药典:一部[Z].北京:人民卫生出版社,2005.[2] 乔传卓,崔熙.大青叶类药材的研究概况[J].中药材,1986,5(3):41-41.[3] 吴启南,王立新,蒋小文,等.大青叶中有机酸药理作用研究[J].南京中医药大学学报,2008,24(3):187-189.[4] 王寅,乔传卓.一阶导数光谱法测定大青叶中邻氨基苯甲酸含量[J].中草药,2000,31(9):664-665.[5] JIA G T, LU X Y. 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