基因克隆载体

细菌人工染色体载体BAC
在大肠杆菌F因子的基础上发展而来，容量 比YAC小，但具有YAC无可比拟的优点：
1. 可稳定遗传 2. 嵌合现象少 3. 操作容易
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YAC）。
酵利于基因克隆 包含的片段可以包含内含子和调控区 克隆的基因可以和酶、转录因子等相互作用
酵母人工染色体载体的不足
1. 存在嵌合现象
插入序列可能来自多个片段
2. 稳定性差
继代培养中容易丢失
3. 分离纯化操作难度大 4. 转化效率低
M13噬菌体载体
M13 噬菌体的增殖
在感染 E.coli 时，会产生临时的双链DNA分子。 双链DNA分子复制到一定数量时，停止复制，＋ 链指导合成相关蛋白，－链指导合成＋链DNA 。
M13噬菌体载体
M13噬菌体的构建策略 在间隔区（IS）添加选择标记基因和克隆位 点。
lacZ’ 基因
一、切去非必需区，抹去多余的限制性酶 切位点
用点突变或甲基化酶处理等方法使必须区内的
酶切位点失效，避免外源DNA插入非必须区。
λ类噬菌体载体的构建策略
二、加入选择标记基因
1. 包装容量 只有特定大小的片段才可以包装，大小选择 2. lac基因 颜色显示
λ类噬菌体载体的构建策略
三、体外包装系统
λ类噬菌体
溶源方式：
进入细菌的λDNA可整合入细菌的染色质DNA中， 细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定 潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体， 含有原噬菌体的细菌称为溶源菌。 λDNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA 中切出，进入溶菌性方式的繁殖。
λ噬菌体载体的构建策略
λ类噬菌体
λ类噬菌体DNA全长48520bp

基因克隆技术的基本步骤随着科技的不断发展，基因克隆技术越来越成为生命科学研究的重要手段。

在生命科学、医学等领域，基因克隆技术的应用十分广泛。

本文将介绍基因克隆技术的基本步骤。

一、选择载体DNA在基因克隆中，载体DNA是将外源DNA（待克隆DNA）转化进细胞的基础。

目前主要的载体DNA是质粒，其一般大小在1至20 kb之间。

质粒的选择应遵循以下几个原则：1. 合适的选体标识。

大多数载体都有一些明显的特征，例如特定的抗生素抗性或颜色，因此选择能够用于筛选的选体标识是基本原则之一。

2. 合适的克隆位点。

载体DNA上应具有克隆位点，以便将待克隆DNA插入到其中。

3. 可重复复制。

质粒必须带有在细胞内自我复制所必需的序列。

二、切割DNA通过限制性内切酶切割将待克隆DNA和载体DNA裂解成短的DNA片段。

这些片段在电泳时可以按照大小区分开，以便以后的克隆工作。

三、将外源DNA插入载体DNA外源DNA和载体DNA的连接需要使用DNA连接酶，如DNA ligase。

方法是将两个DNA片段的末端和连接起来形成一个完整的DNA分子。

连接成功后，形成了一个混合DNA。

由于载体的复制和传递，待克隆DNA也可以被大量复制。

四、将混合DNA转化进宿主细胞将混合DNA转化进宿主细胞是整个克隆过程中至关重要的一步，因为宿主细胞受到质粒的干扰，催化质粒遗传信息的传递与表达。

大多数质粒都需要在易感受性细胞中才能存在并复制。

宿主细胞的选择是非常重要的，有些宿主细胞对外源DNA的吸收和扩增效率非常高，充分利用每一个获得的外源DNA分子。

五、筛选克隆基因最后一步是克隆基因的筛选，筛选克隆基因需要具有合适的筛选方法。

常用的筛选方法是使用抗生素抗性，因为载体上通常带有抗生素基因，能够筛选那些携带载体克隆块的细胞。

克隆基因的筛选方法不止于抗生素抗性，还可以根据不同的克隆目标进行选择。

例如，当克隆目标是蛋白质时，可以使用融合蛋白法克隆兴趣的编码DNA，并利用其蛋白质结构的特点分离出融合蛋白。

23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
基因克隆的质粒载体详解
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。

吸附
LamB受体 注入
复制
包装
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到 50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素， 可达到1000-3000拷贝。 缺点： 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。
Amp Tet
pBR322
插入片段
Tet平板
Amp平板
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。
质粒的基本特征
质粒
质粒的不相容性：分子机制
两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内(亲和性质粒) 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
质粒的基本特征
4. 质粒的重组性
质粒
由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec–）的质粒和菌株。
质粒的基本特征
质粒
5. 携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物
黏性末端
cos
DNA合成控制基因

阻遏基因 早期控制基因