大肠埃希菌质粒DNA提取方法的优选

大肠杆菌质粒DNA的提取实验目的学习和掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的方法实验原理大肠杆菌质粒DNA的提取是从事基因工程工作的一项基本实验技术，碱裂解法是最常用的质粒DNA提取方法之一，其原理是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离的目的；具体为：溶液Ⅰ使细胞悬浮并且EDTA可以与Ca2+ 和Mg2+ 螯和，抑制DNase的活性，溶液II裂解细菌，变性蛋白质和少量质粒，溶液Ⅲ使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀，质粒DNA复性，通过离心吸附柱分离，进行电泳鉴定。

此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。

实验材料、仪器和试剂材料：大肠杆菌DH5α仪器：1.5ml塑料离心管，微量移液枪，台式高速离心机，恒温摇床试剂：质粒DNA提取试剂盒实验步骤和各步骤相应的注意事项一、培养细菌使质粒扩增将带有质粒DNA的大肠杆菌接种在LB液体培养基中，37℃过夜培养。

注意：培养时间不宜过长，一般12~16小时为宜，否则影响细菌质粒的得率。

二、收集和裂解细菌1. 取1.5ml 细菌培养物于EP管中，4000rpm 离心2分钟，弃上清液，收集菌体，使细菌沉淀尽量干燥；注意：上清为培养基，必须倾倒干净，并在吸水纸上吸干，如有较多的培养基残留可能会影响后续实验。

2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的250μl溶液I (50 mmol/L)葡萄糖，10mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0) 中，剧烈振荡；注意：为了保证菌体悬浮均匀，必须充分混匀至看不见沉淀物质，可以用移液枪吹打或者混匀器震荡。

3. 加入250μl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）) ，盖紧EP管口，柔和颠倒离心管（2分钟左右），以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，使溶液变为澄清为止；注意：NaOH溶液最好是新鲜配制，足够的碱性保证其溶解细胞膜的效率；不可剧烈震荡，时间不要过长，否者基因组DNA会断裂。

质粒DNA的提取与鉴定实验日期 2020.5.14 室温 25℃成绩实验报告摘要实验目的：①掌握质粒提取原理和各种试剂的使用②掌握琼脂糖凝胶电泳原理和方法实验方法：琼脂糖凝胶电泳法实验结果：质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图获得三条带，从近到远分别为开环状DNA；线状DNA；超螺旋状DNA实验结论：碱性裂解法可以从大肠埃希菌中提取到质粒DNA实验原理1、质粒是独立存在于染色体，能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。

2、细菌质粒是应用最多的质粒群体，在细菌细胞内利用宿主细胞的复制机构复制质粒自身的DNA。

3、对数期菌体：具有质粒的大肠埃希菌。

4、溶液 I 充分重悬：50 mmol／L 葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

25 mmol／L Tris-HC1(pH 8.0) ：维持PH。

10 mmol／L EDTA(pH 8.0)：二价金属离子的螯合剂、消除游离Mg2+等二价金属离子,抑制DNA酶的活性。

5、溶液II裂解：0.2 mol／L NaOH:主要作用溶解细胞，释放DNA；l％ SDS:阴离子去垢剂。

作用：既能裂解细菌细胞膜，又能使细菌蛋白质变性。

质粒DNA具有特定的形态结构，在特殊环境下，如加热、极端PH等，能变性。

SDS处理细菌细胞能导致细菌细胞壁破裂，释放质粒DNA和细菌基因组DNA。

6、溶液III中和：5 mol／L 醋酸钾：使钾离子置换SDS中的钠离子，形成PDS（十二烷基硫酸钾）。

因为SDS遇到钾离子后变成PDS，而PDS是不溶于水，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀。

冰乙酸：中和NaOH。

去除变性条件后，质粒DNA能复性，在加入强碱NaOH后，通过酸性的醋酸钾中和碱性溶液，质粒DNA便能迅速复性。

需要注意，染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性，所以，离心后，能将质粒DNA留在上清中，染色体DNA则和细胞碎片一起沉淀在离心管底部。

质粒小提试剂盒 （离心柱型） 使用前在漂洗液PW中加无水乙醇 1. 柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入平衡液BL，12000rpm、离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。（使用当天处理过的柱子） 2. 取1-5ml过夜培养的菌液，12000rpm、离心1min（EP管收集3次）尽量吸除上清 3. 向留有沉淀的离心管中加250μl溶液P1（检查是否已加入RNaseA），涡旋彻底悬浮菌体沉淀（不要留有菌块，会影响裂解）。 4. 向离心管中加250μl溶液P2，温和的上下翻转6~8次使菌体充分裂解，室温放置3~5min（温和翻转，不要剧烈震荡。此时菌液变得清亮粘稠，时间应不超过5min，以免质粒受破坏）。 5. 向离心管中加350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6~8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。12000rpm、离心10min。（P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如有微小沉淀可再次离心后取上清）。（此时可做胶，以备检测用） 6. 取上清转移到吸附柱CP3中，不要吸出沉淀。12000rpm、离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。 7. 向吸附柱CP3中加600μl漂洗液PW（检查是否加入无水乙醇），12000rpm、离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。 8. 重复操作步骤7。 9. 将吸附柱CP3放回收集管中，12000rpm、离心2min，将吸附柱中残余漂洗液除去（可将吸附柱CP3开盖放置数分钟，以彻底晾干残余漂洗液）。 10. 将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100μl ddH2O/EB，室温放置2min，12000rpm、离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存。 注意：使用前检查平衡液BL、溶液P2、溶液P3是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清 碱裂解法少量提取质粒 1. 保存菌种 2. 收集菌体到EP管.离心8000rpm，1min,尽可能去上清，重复2-3次 3. 沉淀悬于100ul solution Ⅰ,涡旋 4. 加200ul solution Ⅱ（现用现配，0.4 M NaOH:2% SDS =1:1），轻轻摇匀 5. 加150ul solution Ⅲ ，轻轻摇匀 6. 加600ul 氯仿，轻轻摇匀 7. 离心，11000rpm ,1min 8. 取上清于新EP管，加800ul 预冷无水乙醇（-20℃），混匀 9. 离心，11000rpm ,1min 10. 弃上清，沉淀中加入300ul 70% 乙醇洗 11. 烘干 12. 加30ul RNase 水，轻弹促溶 13. 37℃,30min 14. -20℃ 保存

质粒dna的提取方法质粒DNA提取是分子生物学实验中非常常见的操作，用于从细菌中提取质粒DNA进行后续的实验分析。

下面我将介绍一种常用的质粒DNA提取方法——碱裂解法（alkaline lysis method），该方法简单、快速、成本低且适用于大规模提取。

实验原理：碱裂解法是利用碱性溶液来破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放出其中的质粒DNA。

在碱性条件下，细菌细胞壁和细胞膜会被溶解，质粒DNA则在此过程中被保护在碱性溶液中。

接着，通过中和和沉淀步骤，可从碱性溶液中纯化出质粒DNA。

实验步骤：1. 首先，从含有目标质粒的细菌培养物中制备菌液。

将培养物转移到离心管中，以12000 rpm离心10分钟。

2. 弃去上清液，将菌体沉淀重悬于缓冲液中。

缓冲液的配制：用10 mM Tris-HCl缓冲溶液溶解10 mM EDTA（pH 8.0），并加入0.1 mg/mL的蛋白酶K。

3. 加入缓冲液至菌体重悬菌液中，混匀。

4. 加入等量的0.2 M NaOH-1% SDS（含SDS版本）或0.2 M NaOH-0.5% SDS （不含SDS版本），轻轻翻转混匀。

5. 在室温下孵育5-10分钟，将混合物中的碱裂解酶活化。

6. 加入等体积的3 M醋酸钠（pH 5.5）以中和混合物。

7. 在室温下孵育5-10分钟，使沉淀物凝结。

8. 离心上述混合物，12000 rpm，10分钟。

9. 弃去上清液，加入适量的75%乙醇洗涤沉淀。

10. 再次离心，弃去上清液。

11. 干燥质粒DNA沉淀，通常可以在室温下自然干燥，不要使用高温或吹风机等加热工具。

12. 使用适量的Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0）溶解质粒DNA沉淀，以得到浓度适宜的质粒DNA溶液。

实验注意事项：1. 在实验操作过程中，尽量避免使用手部直接接触NaOH和SDS，以免引起刺激。

2. 防止质粒DNA受到外源DNA（例如基因组DNA）的污染，可在处理前使用DNase酶或RNase酶处理样品。

质粒DNA的提取（3）——密度梯度离⼼法提取质粒DNA
质粒DNA⼀般仅占细胞总DNA的1%-2%，⽽且其化学结构与寄主染⾊体DNA之间并没有太⼤差别，所以质粒DNA的纯化须从两者⾼级结构上的差异寻找依据。

在细菌细胞内，共价闭合质粒以超螺旋(即cccDNA分⼦)形式存在，如图4-3所⽰。

在细胞裂解及DNA分离的过程中，如果质粒DNA两条链中有⼀条发⽣⼀处或多处断裂，分⼦就能旋转⽽消除链的张⼒，形成松弛型环状分⼦，称开环DNA (ocDNA)。

如果质粒DNA的两条链在同⼀处断裂，则形成线状DNA (linear DNA. L-DNA)。

当提取的质粒DNA电泳分离时⼀，同⼀质粒DNA其超螺旋构象的泳动速度⽐开环和线状构象分⼦要快。

将含有EtBr(溴化⼄锭)的CsCI溶液加到⼤肠杆菌裂解液中，EtBr分⼦便会通过嵌⼊作⽤⽽结合到DNA链上，导致双螺旋结构发⽣解旋反应。

⼤肠杆菌染⾊体DNA⽚段具有游离的末端⽽易于解旋，从⽽会结合⼤量的EtBr分⼦。

共价闭合环状的DNA分⼦质粒，只能发⽣有限的解旋反应，限制了EtBr分⼦的结合数量，染⾊体DNA⽚段⽐质粒DNA结合更多的EtBr分⼦。

在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分⼦数量越多，其密度也就越低。

因此，在EtBr达到饱和浓度的条件下，质粒DNA就要⽐线性的染⾊体DNA⽚段具有更⾼的密度。

通过氯化艳密度梯度离⼼之后，它们就会被平衡在不同的位置，从⽽达到纯化质粒DNA的⽬的。

质粒DNA提取概述
一、目的
掌握提取质量DNA提取的原理及方法
二、概述
质粒DNA 小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。

这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。

三、试剂及材料
1.AIQprep miniprep质粒纯化试剂盒
2.离心机
四、操作步骤
1.从1-5ml的过夜培养的LB培养基中分离大肠杆菌，将管底的沉淀
用枪头轻轻打匀。

将250ul的buffer P1加入含细胞悬液的EP管中，混匀至不见细胞团块。

2.加入 250ul的buffer P2轻轻混匀4-6次。

（时间少于5分钟）
3.加入350ul的buffer N3入EP管中，即刻轻轻混匀4-6次。

4.13000g离心10分钟。

5.将离心后的上清液加入QIAprep管中。

13000g离心30-60秒。

弃
液体。

6.加入0.5ml的buffer PB入QIAprep管中，13000g离心30-60秒。

弃液体。

7.加入0.75ml的buffer PE入QIAprep管中，13000g离心30-60
秒。

弃液体。

再13000g离心60秒，去除残余的液体。

8.将QIAprep管置于1.5ml的EP管上，加入 50ul的buffer EB溶
解DNA，静置1分钟，然后离心1分钟。

・实验与技术・大肠杆菌质粒的快速提取3朱　帆1,刘忠纯2,李　健3(1.武汉大学生命科学学院,湖北武汉430072;2.武汉大学人民医院,湖北武汉430072;3.武汉大学口腔医学院,湖北武汉430072)摘　要　质粒的提取是生物学中的常规技术之一,但常规法提取质粒十分复杂,繁琐并且费时。

国外公司的试剂盒大大简化了此过程。

但价格使国内大多数实验室难以承受。

我们利用自制的玻璃粉提取质粒,大大简化了提取过程,同时相对于进口试剂盒而言,实验成本也大大降低。

关键词　质粒;玻璃粉;DNA纯化中图分类号　Q781;Q782 文献标识码　B 文章编号　1005-7021(2004)03-0059-01 常规提取质粒的方法有碱解法[1]、煮沸法[2]等方法。

最近,Promega公司、Pharmacia公司等公司相继推出了DNA纯化试剂盒用于质粒的提取[3]。

碱解法通常存在着方法繁琐,并且费时;煮沸法虽然方法简单,但也存在着其提取物不能直接进行酶切等缺点;而国外的公司的试剂盒虽然克服了传统方法的缺点,大大简化了提取过程,但其价格却是国内大多数实验室难以承受的,不能普遍使用。

本实验则利用自制的玻璃粉提取质粒,使整个提取过程缩短到1h以内,简化了提取过程,提高了工作效率,降低了实验成本,并且提取得到的质粒可直接用于包括酶切、DNA序列测定等在内的各种分子生物学操作。

1　材料与方法1.1　材料GTX TM Micro Plasmid Prep K it购自Amer2 sham Pharmacia公司,RNase A购自Promega公司。

大肠杆菌DH5α,PBS质粒由华美购得,限制性内切酶也由华美购得,其它试剂均为国产分析纯试剂,购自华美。

测序由大连宝生物公司完成。

1.2　方法1.2.1　碱解法提取质粒　5mL菌液离心,得到的菌体用碱解法提取质粒[1]。

1.2.2　DNA试剂盒提取质粒　5mL菌液离心,得到的菌体按试剂盒说明书提取质粒。

质粒dna的提取实验报告质粒DNA的提取实验报告引言DNA（脱氧核糖核酸）是生物体中重要的遗传物质，对于研究生物学和遗传学等领域具有重要意义。

质粒DNA是环状的DNA分子，存在于细菌等原核生物中，广泛应用于基因工程、遗传转化等实验研究中。

本实验旨在通过提取质粒DNA，探究提取方法的可行性和效果。

材料与方法1. 实验材料：- 大肠杆菌培养物- 离心管- 磷酸盐缓冲液- 溶菌酶- 蛋白酶K- 高盐溶液- 乙酸酚/氯仿- 吸附管- 乙醇- 离心机- 紫外可见分光光度计2. 实验步骤：a. 收集大肠杆菌培养物，离心分离菌体。

b. 加入磷酸盐缓冲液，使菌体悬浮液pH值维持在8.0左右。

c. 加入溶菌酶，使细菌细胞壁溶解。

d. 加入蛋白酶K，降解蛋白质。

e. 加入高盐溶液，使蛋白质沉淀。

f. 收集上清液，转移到新的离心管中。

g. 加入乙酸酚/氯仿，使DNA与蛋白质分离。

h. 离心分离水相和有机相。

i. 收集上清液，转移到新的离心管中。

j. 加入乙醇，使DNA沉淀。

k. 离心分离DNA沉淀。

l. 去除上清液，用乙醇洗涤DNA沉淀。

m. 用磷酸盐缓冲液重悬DNA沉淀。

n. 使用紫外可见分光光度计测量DNA浓度。

结果与讨论通过以上提取方法，成功提取到质粒DNA。

在紫外可见分光光度计上测得DNA 的吸光度值为1.8，表明提取到的DNA质量较高。

实验结果表明，该提取方法可行且效果良好。

结论本实验通过提取质粒DNA的方法，成功提取到高质量的DNA样本。

质粒DNA 的提取是基因工程和遗传转化等实验研究的重要步骤，提取到的DNA样本可用于后续实验分析和研究。

本实验结果证明了所采用的提取方法的可行性和有效性，为后续实验提供了基础。

致谢感谢实验中使用的实验材料和设备，以及指导老师的指导和帮助。

参考文献[1] Smith, C. L., & Cantor, C. R. (1987). Purification, specific fragmentation, and separation of large DNA molecules. Methods in enzymology, 155, 449-467.[2] Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual (No. Ed. 2). Cold spring harbor laboratory press.。

大肠杆菌质粒提取碱裂解法大肠杆菌质粒提取是一种用于从大肠杆菌中提取质粒的方法。

碱裂解法是其中一种常用的方法，该方法利用碱性条件下DNA的不稳定性，将细胞壁溶解，并使质粒DNA从细胞中释放出来。

本文将介绍碱裂解法的步骤、原理以及优缺点。

碱裂解法的步骤如下：1.大肠杆菌培养：首先从保存在琼脂板上的大肠杆菌菌落中挑取一株菌，接种到含有适量抗生素的LB培养基中，培养过夜，直到菌液呈现较浓的悬浮液。

2.收取大肠杆菌：将培养液离心，除去上清。

用冷凉的纯水冲洗沉淀两次，将菌沉淀重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液中，pH 8.0。

3.制备碱性溶液：在50 mM Tris-HCl缓冲液中加入0.2 M NaOH 和1% SDS，混匀制成碱性溶液。

4.碱性裂解：将菌悬液与等体积的碱性溶液混匀，使菌细胞在碱性条件下裂解。

孵育数分钟至十几分钟，直至溶液变为粘稠状。

5.酸性中和：加入等体积的3 M醋酸，酸性中和碱性溶液。

此步骤中，质粒DNA会从溶液中析出沉淀。

6.离心：用高速离心将沉淀离心下来，除去上清。

7.溶解：用适量的纯水将沉淀溶解，可以通过轻轻摇动溶液使其充分溶解。

8.纯化：通过离心或其他纯化方法，如柱层析、琼脂糖凝胶电泳等技术，纯化目标质粒DNA。

碱裂解法的原理是利用碱性条件下DNA的不稳定性。

当细胞处于高pH环境中时，碱性条件会破坏大肠杆菌的外膜，使细胞壁失去完整性。

此时，细胞内的DNA易于释放出来，包括质粒DNA。

然后，通过酸性中和反应将质粒DNA沉淀下来。

最后，通过纯化步骤，可以得到高纯度的质粒DNA。

碱裂解法的优点是简单易行，不需要较昂贵的设备和试剂，并且可以在相对短的时间内提取到目标质粒DNA。

此外，这个方法适用于大多数质粒类型和质粒大小。

碱裂解法适用于小规模提取或初步提取，用于大规模提取时效率较低，不推荐使用。

然而，碱裂解法也存在一些缺点。

首先，该方法提取到的DNA含有RNA、蛋白质和其他污染物。