利用活体微生物农药防治铁皮石斛黑斑病研究

植物护理学　《现代农业科技）２００９年第２０期　

利用活体微生物农药防治铁皮石斛黑斑病研究　

周术涛雷志力俞巧仙叶智根　

（浙江森宇控股集团有限公司，浙江义乌３２２０００）　

摘要为利用活体微生物控制铁皮石斛生长过程中出现的黑斑病，采用测量抑茵圈的方法，通过从铁皮石斛土壤中筛选到的１５种抑　制菌，对显著抑制石斛黑斑病原茵的拮抗微生物进行了优选，并研究其单一发酵液和复合发酵液对石斛黑斑病菌的抑制作用。结果表明：　筛选出的细菌进行单一发酵液试验，细茵玩、Ｂ　和Ｂ，。有较强的抑茵能力；进一步将单一发酵液两两复合后发现，部分复合发酵液出现了　明显的增效作用，其中抑茵能力最高及增效作用最强的是细菌Ｂ６和Ｂ８浓度为１０．０ｍｇ／ｍＬ的复合发酵液，抑茵圈直径达到了３２．４ｍｍ，该　方法简便，费用低，实验周期较短，现象容易观察，适合小型的实验室研究。　关键词铁皮石斛：活体微生物农药；黑斑病；抑制作用　中图分类号￥５６７．９　文献标识码Ａ　文章编号１００７－５７３９（２００９）２０—０１６６—０２　

Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｕｓｉｎｇ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ　ｔｏ　Ｃｏｍｂａｔ　Ａｉｔｅｒｎａｒｉａ　ｉｎ　Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｚＨｏＵ　Ｓｈｕ－ｔａｏ　ＬＥ１　Ｚｈｉ—ｌｉ　ＹＵ　Ｑｉａｏ—ｘｉａｎ　ＹＥ　Ｚｈｉ－ｇｅｎ　（ＺｈｅｊｉａｎｇＳｅｎｙｕｈｏｌｄｉｎｇｇｒｏｕｐＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｙｉｗ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ３２２０００）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｕｓｅ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ　ｔｏ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｂｌａｃｋ　ｓｐｏｔ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ，ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｚｏｎｅ．１５　ｋｉｎｄｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｓｏｉｌ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｓｐｏｔｓ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ａｎｄ出ｅ　ｓｉｎｇｌｅ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ　ｕｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆｂａｃｔｅｒｉａ　ｆｒｏｍ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ　ｔｏ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｔｅｓｔ，ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｂ６，Ｂｓ　ａｎｄ　Ｂ１ｏ　ｈａｄ　ａ　ｓｔｒｏｎｇｅｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃａｐａｃｉｔｙ，ｔｈｅｎ　ｆｕｒｔｈｅｒ￣ｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ　ｔｏ　ｔｗｏ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｅｄ　ｔｅｓｔ　ａｎｄ　ｆ０ｕｎｄ　ｓｏｍｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ　ｈａｄ　ａ　ｃｌｅａｒ　ｂｒｏｔｈ　ｓｙｎｅｒｇｉｅｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｔｈｅ　ｌ１ｉｇｈｅｓｔ　ａｎｄ　ｍｏｓｔ　ｐｏｗｅｒｆｕｌ　ｓｙｎｅｒｇｙ　Ｂ６　ａｎｄ　Ｂ８　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　１０　ｍｇ／ｍＬ　ｏｆｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｆｌｕｉｄ，ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｚｏｎｅ　ｄｉａｍｅｔｅｒ　ｏｆ　３２ｒａｍ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ｌｏｗ—ＣＯＳｔ，ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｓｈｏｒｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｃｙｃｌｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ　ｏｆ　ｉｓ　ｅａｓｙ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｆｏｒ　ｓｍａ】１一ｓｃａｌｅ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ；ｍｉｃｒｏｂｉｃａｌｐｅｓｔｉｃｉｄｅ；Ａｌｔｅｍａｒｉａ；ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　

铁皮石斛的黑斑病，危害叶片，使叶片枯萎。其确定分　离的交链孢真菌为细极链格孢，学名为Ａ．ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ。目前使　

用化学药剂是主要的防治方法，但由于病菌菌株的抗药性、　

农药残留及严重的环境污染等问题，使得寻求安全有效的　

生物防治方法成为研究热点。实验主要采用以菌治菌的防　

治方法，以种植铁皮石斛的土壤为原材料，从中筛选出代谢　

产物对铁皮石斛黑斑病原菌具有较强抑制作用的细菌，即　微生物农药防治法，同时在研究单一发酵液的基础上，进一　

步对发酵液复合后的抑菌能力做了研究。近年来，微生物农　

药由于其高效、低毒且不污染环境等诸多显著优越性而越　

来越受到人们的关注，因此，加快活体微生物农药的研制必　

将产生巨大的社会、经济和生态效益。　１材料与方法　

１．１试验材料　１．１．１菌种。铁皮石斛黑斑病源菌，病害标本采集于浙江省　

义乌市铁皮石斛栽培基地，并在室内对其病原菌进行分离　

和纯化，获得试验所用的石斛黑斑病菌株；细菌Ｂ　，浙江　省义乌市铁皮石斛栽培基地土壤中筛选得到。　

１．１．２培养基。牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏３．０ｇ、蛋　

白胨１０．０ｇ、ＮａＣ１　５．０ｇ、葡萄糖３Ｏ．０ｇ、琼脂１５．０ｇ、水１　０００　

ｍＬ、ｐＨ　７．０）；牛肉膏蛋白胨发酵培养基（配方同上，不含琼　

脂）；ＰＤＡ培养基（马铃薯煮汁１　０００ｍＬ、蔗糖２００．０ｇ、琼脂　

１５．０ｇ、ｐＨ自然）。　１．１．３实验仪器。ＳＨＡ—Ｂ水浴摇床，常州国华电器有限公　

司；ＨＮＰ一１水平流型超净工作台，南通沪南科学有限公司；　

ＨＮ３０３－４Ａ电热（隔水）培养箱，南通沪南科学有限公司；　

ＤＮＰ－４０电热恒温培养箱，光明医疗仪器厂；１０１—２Ａ数显　

收稿日期２００９—０８—０７　

１６６　式恒温干燥箱，上海阳光实验仪器有限公司；ＳＺ一９３自动双　

重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；ＦＡ１　１０４电子天平．上　

海精科天平；ＰＨＳ２Ｃ酸度计，上海理达仪器厂；ＢＩ－２２０Ａ光　

学显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司；电热手提压力蒸汽　

灭菌器，上海申安医疗器械厂。　

１．２试验方法　

１．２．１菌种筛选。取土样５．０ｇ，加入到装有４５ｍＬ无菌水的　

锥形瓶中，振荡ｌＯｍｉｎ，静置２０ｍｉｎ，将土样溶液依次稀释到　

１０～、１０～、１０～、１０一、１０一。分别取１０一、１０　的土样稀释液　

ｌｍＬ，滴加在牛肉膏蛋白胨平板上，用涂布棒涂匀，每个稀释　

度作５个平板。将制好的平板放置在３７ｑＣ的恒温培养箱中，　

培养２４ｈ。从培养好的平板上挑取单菌落，分别传至试管斜　

面，并进一步进行摇瓶培养，得到发酵液待用。取长势良好　

的铁皮石斛黑斑病原菌试管斜面１支，向试管斜面中加入　

无菌水８ｍＬ，刮铁皮石斛病原菌的孢子，吸取孢子悬液ｌｍＬ加　

入２９ｍＬ无菌水中，振荡２０ｍｉｎ，使之成为分散均匀的孢子　

悬液。吸取ｌｍＬ均匀的铁皮石斛病原菌孢子悬液于无菌平　皿中，再倒入ＰＤＡ培养基内，制成铁皮石斛黑斑病菌混菌　

平板。在黄瓜枯萎病菌制成的混菌平板上分别贴上无菌的滤　

纸片，每个平板贴５个，在５个滤纸片上分别滴加上述由土　

样中分离得到的细菌单菌落制成的发酵液，加量为ｌＯｐ￣Ｌ，　

培养５ｄ后，根据形成抑菌圈的情况挑选出出发菌株。　

１．２．２拮抗菌发酵液的制备。将筛选出的菌种经活化培养　

后，接种在ＰＤＢ（马铃薯蔗糖培养液）上，接种量为每１００ｍＬ　

ＰＤＢ放入菌饼（　＝７ｒａｍ）３片，于２５￣Ｃ静置培养８ｄ，拮抗菌　

培养液经离心（４￣Ｃ、１５　Ｏ００ｒｐｍｉｎ、１５ｒａｉｎ）、过滤除菌（瓶顶过　

滤装置）、冷冻干燥后配成１０ｍｇ／ｍ＿Ｌ的溶液，４℃保存备用。　

１．２．３

单一菌株发酵液对石斛黑斑病原菌的抑制作用。利　《现代农业科技）２００９年第２０期　植物护理学　

用滤纸片法筛选具有显著抑菌作用的拮抗微生物发酵液，　

将活化培养的石斛黑斑病原菌饼（　＝７ｍｍ）接种于培养基　

平板（　＝９０ｍｍ）中央，在菌饼上下左右各相距２５ｍｍ处对　

称放置１片无菌滤纸片（中＝ｌＯｍｍ），其中３片分别滴加２０　Ｌ　供试菌种的发酵液原液，另１片加同体积无菌水作对照。　

２０℃培养，观察统计抑菌作用；进一步将有显著抑菌作用的　

发酵液用无菌水配成１０．０ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ和　

２．５ｍｇ／ｍＬ的４种不同浓度梯度，进行抑菌试验。每个处理　

重复３次。　

ｌ－２．４复合发酵液对石斛黑斑病原菌的抑制作用。选择抑　

菌作用的单一发酵液，将其原液或不同浓度的发酵液按１：１　

体积比例两两混配成复合型酵液，进行抑菌试验，方法同　

上。每个处理重复３次。　

２结果与分析　２．１单一发酵液对石斛黑斑病菌的抑制结果　

从铁皮石斛土壤中经过初筛，共得到１５株出发菌对铁　

皮石斛病原菌具有抑制能力，其抑制能力强弱见表１，不同　

浓度对黑斑病菌的抑制作用见表２。　

表１单一细菌对病原茵的抑制结果　（一）　

菌种编号　抑菌圈直径　菌种编号　抑菌圈直径　１　１５．５　９　１６．０　２　１３．５　１Ｏ　１８．５　３　１４．Ｏ　１１　１６．５　４　１６．Ｏ　１２　１５．Ｏ　５　１５．４　１３　１２．０　６　１９．３　１４　１５．２　７　１４．７　１５　１１．８　８　２３．Ｏ　

表２不同浓度梯度单一发酵液对黑斑病菌的抑制作用　（ｍｍ）　

由表１可以看出，对黑斑病菌抑制能力最强的为细菌　

Ｂ　，　和Ｂ　。也具有较强的抑菌作用。由表２可以看出，单一　

发酵液配成不同浓度梯度的发酵液，在７．５ｍｇ／ｍＬ浓度下　

Ｂ８和　发酵液的抑菌作用最高，抑菌圈直径分别达到了　

２６．０ｍｍ和２０．０ｍｍ；细菌Ｂ　。发酵液的抑菌作用随发酵液的　

浓度增加而明显增强。　

２．２复合发酵液对黑斑病原菌的抑制作用　

将供试微生物的发酵液两两复合后进行抑菌试验，结　

果表明（表３）：大部分微生物的发酵液复合后与其单独使用　

的效果一样，但部分发酵液与Ｂ　或Ｂ。复合后表现出了显著　

的增效作用。在分别与Ｂ　或Ｂ。进行复合的１３个组合中，有　

９个出现了增效作用，其中单独使用抑菌作用显著的Ｂ　和Ｂ　

发酵液复合后抑制率最高（抑菌圈直径达到了３２．４ｍｍ），增　

效作用最明显；明显优于２种发酵液单独使用的效果。Ｂ　与　Ｂ　。发酵液复合后的效果次之，抑菌圈直径达到２７．０ｍｍ，复　

合发酵的抑菌率比单独使用的效果有了非常明显的提高。　

２．３不同浓度的复合发酵液对黑斑病原菌的抑制作用　

将有显著抑菌作用的细菌Ｂ　与细菌Ｂ。的发酵液稀释　

成不同浓度后，把相同浓度的发酵液以等体积复合，发现浓　表３复合发酵液对石斛黑斑病原菌的抑制作用（一）　

复合发酵液　抑菌圈直径　复合发酵液　抑菌圈直径　Ｂ６＋Ｂ８　３２．４　Ｂ６＋Ｂ２　１８，３　Ｂ６＋Ｂｌｏ　２７．０　Ｂ８＋Ｂ７　１７．２　Ｂ８＋Ｂ１ｏ　２４．０　Ｂ８＋Ｂ５　１７．０　Ｂ６＋Ｂ７　２３．５　Ｂ８＋Ｂ１３　１６．２　Ｂ６＋Ｂ５　２３．０　Ｂ８＋Ｂｌ１　１５．３　Ｂ６＋Ｂ”　２０．２　Ｂ８＋Ｂ２　１４．２　Ｂ６＋Ｂｌ１　１９．４　

度为１０．０ｍｇ／ｍＬ的复合发酵液的抑菌效果均显著高于其他　

组合（图１），其他浓度下复合发酵液的抑菌率虽然均低于Ｂ　发酵液但均高于Ｂ　的发酵液单独作用的效果，差别不显著。