广西优质黄皮种质资源ISSR分子遗传多样性分析

第３期　河北林业科技　２０１５年６月　

广西优质黄皮种质资源ＩＳＳＲ分子遗传多样性分析　

王惠君　，卢　诚　．一，黎明　，陈友　

（１．琼州学院商学院，海南三亚５７２０２２；２．中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海Ｅｌ　５７１１０１）　

摘要：该文将ＩＳＳＲ技术应用在广西优质黄皮种质资源分子遗传多样性分析研究上，对２４份广西黄皮品种种质资　

源材料进行分析，最终获得１７２个位点。按照遗传相似性系数构建聚类图。结果显示：黄皮具有比较丰富的遗传多样性，　

可进一步拓展黄皮种质创新利用新局面。该试验为黄皮形态学的鉴定也提供了一定的技术支持，为新品种的开发提供新　

的思路和方法。　

关键词：ＩＳＳＲ；种质资源；黄皮；遗传多样性　

中图分类号：Ｑ一９４３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２—３３５６（２０１５）０３—０００１—０４　

早在９０年代石健泉【ｎ、熊子成囡对广西黄皮种质资源　

进行过调查，之后的２０ａ间对黄皮的研究大都在黄皮果的　

营养价值１３１、化学成分　、栽培技术［６－７１、开发利用阎等方面。　

随着当代社会快速发展，原有的优良黄皮种质资源不能满　

足于市场的需求，迫切需要对原有优良黄皮品质进行改　

良，尤其是黄皮果果品品质的储运方面缺陷成为黄皮产业　

的瓶颈，同时广西各地黄皮资源的质量性状参差不齐［９－　２１，　

且果实口味各不相同，黄皮原材料将很难大规模开发利　

用。利用分子辅助育种方法用于发掘优良品质资源或改良　

有部分缺陷的优良资源在现代栽培种植中就显得具有紧　

迫性。分子遗传多样性方面的研究比较薄弱，综合比较各　

类分子标记的优势，本研究选用操作简便具有较好的重复　

性且多态性较为丰富的ＩＳＳＲｔｌ３　母标记技术做黄皮亲缘关　

系和遗传多样性分析，为今后的品种选育和分子辅助改良　

育种提供一定的分类依据。　

１材料与方法　

１．１材料　

２４份黄皮种质，如表１所示。　

１．２方法　

１．２．１　ＩＳＳＲ—ＰＣＲ扩增反应体系的建立　

基因组ＤＮＡ采用实验室成熟的方法改良ＣＴＡＢ法【　

提取，通过正交实验方法对ＩＳＳＲ—ＰＣＲ扩增反应进行优化　

后建立２０ｔｔＬ反应体系，其中ＩＳＳＲ引物为ＵＢＣ公布的序　

列㈣。反应体系如下：Ｔａｑ酶量１．５Ｕ，ＤＮＡ模板为５０ｎｇ，引　

物浓度为０．５ｌａ，ｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ浓度为０．３ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｍ　浓度为　

２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，最后用超纯水补充至２０ｐ，Ｌ。扩增反应程序如　

收稿日期：２０１５—０５—０７　

基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３１２６１１４０３６３）、　

广西自然科学基金项目（项目编号：２０１２ＧｘＮＳＦ１ＢＡ０５３０８１）　

资助。　表１　２４份黄皮种质信息　

下设置：预变性温度，时间一９４￣Ｃ／５ｍｉｎ；变性温度，时间一　

９４￣Ｃ／３５ｓ；退火温度，时间一５０￣Ｃ／６０ｓ；延伸温度，时间＿７２℃，　

９０ｓ，３７个循环，最后延伸一７２℃（１０ｒａｉｎ），扩增产物将贮存　

于４￣Ｃ条件下。　

１．２．２数据的分析和处理　

呈现为显性标记的ＩＳＳＲ分子标记，在数据分析时根　

据该分子标记特点的迁移率及有无来统计，无条带统计为　

０，有条带统计为１，强、弱条带均统计为１，将数据以“０，１”　

输入Ｅｘｅｌｅ　２００３文档中构建矩阵数据，统计出总带数、多　

态性条带数、各引物多态性比率。用生物学ＮＴＥＤＩＴ软件　

将该矩阵数据转换为可用于聚类分析软件ＮＴＳＹＳ—ＰＣ分　

析的ＮＴＳ矩阵数据格式，然后将计算得出的遗传相似系　

数数据按照ＵＰＧＭＡ方法进行聚类分析，绘制出该物种的　

树状聚类图。　

２结果与分析　

２．１多态性分析　

该实验从９６个引物中，筛选出１８个多态性丰富、重　

一

１一　第３期　河北林业科技　２０１５年６月　

ｌ１　１舢　

ｌ９　Ｏ．９５ｌ　１．００ｏ　

ｌ７　０．９３９　ｎ９６５　１．０００　

２４　ｎ８９２　０．９３７　０．９０２　ｌ－咖　

ｌ５　０．９１３　０．９５８　ｎ９２３　０．９７０　１．Ｏ０ｏ　

ｌ２　０．９３２　０．９７７　０．９４１　０．９６０　０．９８１　１．０００　

ｌ　ｎ９３２　０．９７７　０．９４ｌ　０．９６０　０．９８１　ｌ删ｌ＿咖　

１４　０．７Ｂ７　０．７７５　ｎ７５９　０．７２６　０．７４７　０．７６６　０．７６６　ｌ｜０００　

２３　０．８５０　０．８３８　０．８２２　０．７８９　０．８１０　０．８２９　０．８２９　０．８９０　１．０００　

７　０．７５２　０．７９６　０．７７０　ｎ７８０　０．８０１　０．８２０　０．８２０　Ｏ．舳１　ｏ．７３８　１．０００　

８　０．８０６　０．８５０　０．８２９　０．８３４　０．８５５　０．８７４　０．８７４　ｎ８４ｌ　０．７７８　ｎ８６２　１．００ｏ　

２　０．８２７　ｎ８５２　０．８２２　０．８３６　０．８５７　０．８７６　０．盯６　０．８３４　ｎ７７０　０．８７８　０．９６０　１＿伽０　

５　０．７３３　０．７柏０．７３８　０．７７５　０．７４９　０．７３５　０．７３５　０．６９３　０．７１９　０．６７２　０．６９３　Ｏ．７００　１．Ｏ０ｏ　

ｌＯ　０．７４２　０．７４９　０．７４７　０．７２８　０．７３５　０．７４０　０．７４０　ｎ７０３　０．７２８　ｎ６７７　０．６９８　０．７０５　０．９３９　１．０００　

２２　Ｏ．６４９　ｍ　４　０同『２　ｍ６５３　０．６６５　０Ｊ５７０　ｏ．Ｉ订０　０．６５１　ｍ６６７　Ｏ．６７２　Ｏ．６８９　０　｜７　０．７１４　０．７４７　１．０００　

１６　０．７１２　０．７３８　０．７３５　０．７３１　０．７３８　０．７４２　０．７４２　ｎ７１４　ｎ７３１　０．６９３　０．７６１　０．７４０　０．７９６　０．７９６　０．８９９　ｌ＿０００　

４　０．７０５　０．７０３　ｎ７１９　０．６ｓ６　ｍ６９３　０．６９８　Ｏ．６９８　７２６　Ｏ．７４２　ｎ６４４　０．７１２　０．６９６　０．７７５　０．ｓ０８　Ｏ．８６９　０．９０４　ｌ＿加０　

９　０．７０５　０．７３１　０．７２８　０．７２８　０．７３５　０．７４０　０．７加０．６８４　ｎ７００　０．６８ｌ　０．７２１　０．７３３　０．７８９　０．８２７　０．８６９　０．９１８　０．９３０　１．Ｏ００　

２１　０．７７５　０．７４５　０．７６１　０．７３８　０．７４５　０．７４９　０．７４９　０．７３５　０．７８５　０．６７２　０．７４０　０．７１０　０．７９９　０．７８９　０．８１７　０．８９０　ｎ８７４　０．８３６　１．０００　

３　０．７４７　０．７７８　０．７６６　０．７６６　０．７７３　０．７７８　０．７７８　０．７０７　０．７５６　０．７Ｏ０　０．７６８　０．７５６　０．８０８　０．７９９　０．８３６　０．９０９　０．８７４　０．８６９　０．９４４　１．０ｏ０　

１３　０．７３５　０．７５６　０．７５９　０．７４９　Ｏ０７５６　０．７６１　０．７６ｌ　Ｏ．６９６　ｎ７４５　Ｏ．６７９　０．７４７　０．７１７　０．８０１　０．７９２　０．８１０　０．８８３　０．８８１　０．８８５　０．９４６　０．９５６　１．Ｏ００　

２ｏ　Ｏ．６９１　０．６６０　０．６７７　０．６３９　０．６５６　０．６６ｏ　０．６６０　ｎ６７９　ｎ７００　ｎ６５３　０．６８４　０．５３　０．６９６　０．７５６　０．８６４　０．８３８　０．８３１　ｎ７９９　０．８７４　０．８１７　０．８２０　１加０　

６　０．６５６　０．６５８　０．６５１　Ｏ矗７４　０．６７２　０．６６３　０．６６３　０．６１６　０．６５１　ｎ６４６　０．６４４　０．６４６　０．７６８　０．７５９　０．６２８　０．６５３　Ｏ．６６０　０．６７Ｏ　Ｏ．６８４　０．６９３　０．６８６　０．６５６　１．００ｏ　

１８　Ｏ．６３７　０．６３９　０．６３２　０．６６ｏ　０．６５８　Ｏ．６４９　０．６４９　Ｏ．６５８　ｎ６０９　Ｏ．６７０　ｎ６８ｌ　Ｏ．６８４　０．７３５　０．６３７　０．６３７　０．６６７　ｎ６７０　０．６７４　０．６３２　ｎ６４２　０．６３５　０．６１４　０．８９２　１．０００　

０　０．７５　Ｏ．８３　０．９２　

图２基于ＩＳＳＲ标记的２４份品种材料的ＵＰＧＡＮＥ聚类分析图谱　

奶黄皮品种由于来源不同，遗传相似系数较远，很有可能　

是由地域阻隔等外界因素的影响对遗传背景产生的变异。　

在Ⅱ群体中包含有大圆头、卵形和鸡心黄皮３个品种。虽　

然有地域上的差异，但是从整体上看都是以相同品种的黄　

皮首先聚合在一起。其中只有一个鸡心黄皮品种有交叉，　

在遗传相似性系数为０．８３６时河池鸡心（２Ｏ）与卵形、大圆　

头黄皮聚合在一起，当遗传系数为０．７８２时河池鸡心　

（２０）、卵形、大圆头与南宁鸡心（５）和玉林鸡心（１Ｏ）聚合在　一起。在进化地位上推断，很有可能卵形和大圆头是由鸡　

心品种进化而来。要想明确具体进化情况要做进一步的研　

究。在ＩⅡ群只有山黄皮一个品种，在南宁山黄皮（６）和梧　

州山黄皮（１８）遗传相似系数在０．８９３时才聚合，同时也可　

以说明由于山黄皮属于小众水果，有的山黄皮资源属于半　

野生状态，由于地域的阻隔，遗传基因交流也相对较少。山　

黄皮与黄皮属于同一个属但不同种，在聚类分析的数据结　

果中山黄皮与其他各类黄皮的遗传相似性系数为０．６６０，　

一３一　¨＂　７　８　２¨　５　ｍ　４　９　

３”第３期　河北林业科技　２０１５年６月　

相似性相对较小，这一结果与传统的形态学标记分类相吻　

合，也为山黄皮与黄皮的亲缘关系提供了科学的技术支　

持。由于山黄皮与黄皮的遗传的差异性相对较大，因而山　

黄皮可以作为优质黄皮品种改良的潜在基因库。　

品种遗传改良的各种方法中，作为最为原始的人工杂　

交方法是最为有效的。如果遗传背景较为复杂的条件下，　

凭借传统的方法如形态学标记、生化标记、细胞标记等方　

法还余存较多的争议，无法判断两两品种之间的遗传背景　

现状。因而传统遗传改良育种方法带有盲目性。为了解各　

个品种之间的亲缘关系，我们可以采取分子标记的方法，　

快速的对所提供的优良品种在分子水平进行分析各品种　

之间的亲缘关系。利用亲缘关系较远的品种间进行遗传改　

良育种，为今后更有目标、有预见的引种和育种，进而缩短　

育种年限和提高育种效率提供理论依据，同时也可为所研　

究品种间的亲缘关系和进化地位提供佐证。在此试验中选　

择的广西各地主要推广的８个优质黄皮品种种质资源进　

行分析，从所得的聚类分析结果上与传统的形态学分类方　

法大致相同。　

４结论　

在９６个的ＩＳＳＲ—ＰＣＲ引物中筛选出１８个具有重复　

性和多态性较好引物，对２４份优质推广黄皮品种种质资　

源材料进行ＩＳＳＲ分子标记技术分析，共获得１７２个位点，　

其中的１０５个是具有多态性的，多态性比率为６１．０％。在　

遗传相似性系数为０．７１８时将２４份黄皮品种种质资源　

分为３个大群。该试验结果不仅在黄皮形态学上分类鉴　

定提供了佐证，也为优质黄皮品种间的亲缘关系给予初　

步鉴定，为优质黄皮品种种质资源的开发研究领域提供新　

的方法。　

参　考　文　献　

［１］石健泉．广西黄皮果资源调查［Ｊ］．西南农业学报，　

１９９１，４（４）：１５—１９．　

［２］熊子成．钦州地区黄皮种质资源调查［Ｊ］．广西农业科