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双向电泳技术原理及其应用

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¹双向电泳技术原理及其应用刘上峰 傅俊江 综述 李麓芸 审校(中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室,湖南长沙410078)

摘要:双向电泳技术是蛋白质组研究的核心技术之一,本文对其基本原理、分辨率、可重复性、相关数据库、减法分析等作了介绍,并对其今后的发展方向作了展望。关键词:双向电泳; 蛋白质组; 数据库; 减法分析中图分类号:R318133 文献标识码:A 文章编号:100121773(2002)0220197203

随着后基因组时代的到来,蛋白质组学应运而生。双向电泳(two2dimensionalelectrophoresis,22DE)作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一(另二种是质谱技术和计算机图像数据处理与蛋白质组数据库即蛋白质组信息学),仍然是目前分析组份复杂蛋白质分辨率最高的工具,因此日益受到人们的广泛关注。1 双向电泳的基本原理首先根据蛋白质等电点不同在pH梯度胶中等电聚焦(isoelectricfocusing,IEF)将其分离,然后按照它们的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PAGE)第二次分离。根据第一向等电聚焦条件的不同,可将22DE分为三种系统:第一种系统是在聚丙烯酰胺凝胶中进行,两性电解质在外加电场作用下形成梯度,该系统称为ISO2DALT。其主要缺点是pH梯度不稳定,重复性差,上样量低,不利于不同实验室间进行图谱比较;如果第一向电泳使用丙烯酰胺和Immobilines共聚,形成具有pH梯度的凝胶,这种系统称为IPG2DALT系统,该系统pH梯度稳定,不依赖于外加电场,基本上克服了ISO2DALT的主要缺点,无论是重复性和上样量均优于ISO2DALT;第三种是非平衡pH梯度电泳(nonequilibriumpHgradientelectrophoresis,NEPhGE),主要用于分离碱性蛋白质,电泳展开时间相对比较短。2 双向电泳的技术特点及存在的问题2.1 分辨率 双向电泳分辨率高。自Smithies等[1]第一次应用22DE分离蛋白质以来,这种技术的分辨率已从15个蛋白质点发展到10000个蛋白质点[2],一般的22DE能分辨1000~3000个蛋白质点。常用改善分辨率的主要措施有:应用复杂的两性电解质,减少凝胶厚度(1.5~0.5mm)以及增大凝胶面积(30cm~40cm)。Humphery2Smith等[3]创立了蛋白质组重叠群(proteomiccontig)来提高分辨率,即利用多块不同pH梯度和/或分子量上相互重叠的双向电泳图谱,拼接成一张完整的双向电泳图谱。但因细胞内含有3~5万种蛋白质,远远不能满足需要。尽管在膜蛋白制备和双向电泳pH梯度范围扩展[4~6]上有了较大改进,应用极窄pH梯度胶分离蛋白质组已有报道[7],但对细胞内的低拷贝蛋白、极端酸性或碱性蛋白、分子量过大或过小蛋白、难溶蛋白(包括膜蛋白)等的电泳分离和检测仍面临很大困难。要真正解决此问题还需进一步研究。2.2 可重复性 为提高22DE凝胶的重复性,引入了固定的载体两性电解质Immobiline[8],可是由Immobiline222DE凝胶难以获得同等的重复性数据,实验表明[10],虽然其蛋白质点相对位置有较好的重复性,但其蛋白质点数最多可相差500多点。通过简化程序可以提高重复性,例如省去浓缩胶,在第二向电泳中使用连续的分离胶等。在得到高质量的可重复的电泳图谱中,实践经验也是非常重要的。对整个22DE过程的自动化已经做了初步尝试[10,11]。2.3 染色 常用蛋白质点的染色方法有银染、荧光染料、氨基黑、印度墨等。银染法灵敏度高,可以在蛋白质中找到含量较低的蛋白,且所需的上样量较少(每点仅需0.1ng)。但银染法也有许多缺点,如一些条带的可重复性差,动力学范围较小,一些普通的蛋白质染色较差甚至根本没有,并且银染法很费人力,对以后的质谱测定也有干扰。与此相比,荧

197¹收稿日期:2001203219 修回日期:2001211204作者简介:刘上峰(19712),男,广东广州市人,中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室博士,从事遗传病的基因诊断、分子克隆等方面的研究。

第22卷第2期2002年4月国外医学#生理、病理科学与临床分册

ForeignMedicalSciences#SectionofPathophysiologyandClinicalMedicine Vol.22 No.2Apr. 2002光染色虽然灵敏度稍低但具有较高的重复性,且容易完成。3 应用3.1 凝胶图像处理和双向电泳数据库 蛋白质的双向电泳显示了众多的蛋白质斑点,用图像扫描仪、荧光测定仪等采集原始图像,经背景和污点的校正,滤掉一部分背景及去除部分水平和垂直条纹,把凝胶上的蛋白质点数字化,得到斑点面积,每点相对黑度等参数。根据标准蛋白(也可用内标,即蛋白质组内的成员),得到每个蛋白斑点的等电点和相对分子量,这就可建立数据库。随着需要检测的蛋白质斑点的增多以及凝胶的加大,仅靠目测几乎不太可能,只有选择合适的软件工具方能易于从中提取到有用的信息。目前最常用的是MelanieÒ,可访问ExPASy服务器。常用的22DE相关数据库如表1。

表1 双向电泳数据库数据库说明网址WORLD22DPAGE国际2DPAGE库的完整索引http://www.expasy.ch/ch2d2index.htmlLinkto2DPAGEPhoretix公司的联络表http://www.phoretix.com/links.htm2DWG二维电泳图谱库http://www2lecb.ncifcrf.gov/2dwgDB/Flicker成对电泳图谱比较http://www2lecb.nciferf.gov/flicker/HSC22DPAGE人、狗和大鼠的心脏http://www.harefield.nthames.nbs.uk/nhli/protein/SWISS22DPAGE10多种人组织样本、大肠杆菌、酵母等http://www.expase.ch/ch2d/ch2d2top.htmlDanish22Ddb角质细胞、膀胱癌、尿液及其他人组织液和体液等http://biobase.dk/cgi2bin/celis/Heart22DPAGE人心脏http://wwwchemie.fuberlin.de/user/pleiss/dhzb.htmlLSB22Ddb鼠、人的肝和谷物等http://www.lsbc.com/2dmaps/patterns.htmYEAST22DPAGE五种酵母http://yeast22dpage.gmm.gu.se/EmbryonalStemCell胚胎干细胞http://www.ed.ac.uk/nh/2DPAGE.htmlColonCarcinoma结肠癌http://www.ludwig.edu.au/www/jpsl/jpslhome.htmlUCSF2DPAGE黑色素瘤细胞株http://rafael.ucsf.edu/2DPAGEhome.htmlECO2DBASE大肠杆菌http://ncbi.nlm.gov/repository/ECO2DBASEQUESTRef52细胞、大鼠胚胎、酵母http://siva.cshl.org/

3.2 减法分析 与经典的生物化学方法不同,采用减法分析[12],可以阐明生物学变化相关的蛋白质,如疾病相关的蛋白质。双向电泳的最大优势在于它可对一系列复杂的蛋白质进行分析,而不仅仅是某一个蛋白质的变化。首先将疾病和对照组相关部位的蛋白组进行双向电泳,然后以图像扫描数字化的22DE上分离的蛋白质点,在蛋白图形工作站上,应用MelanieÒ软件,对数字化的蛋白点的分布部位、斑点面积及灰阶、背景过滤、进行22DE匹配及比较,建立参考图谱。对比找到斑点的变化,如附加斑点,丢失斑点以及强度上的差异等。对该蛋白进行各种蛋白质分析,再进行蛋白库搜索,这样往往能发现新的疾病相关蛋白。3.3 双向凝胶电泳蛋白质点的矢量图 双向凝胶电泳蛋白质点的矢量图(vectormapofthe22Dgel)[13]亦被经常使用。翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的,其变化往往与疾病的发生相关。如果将双向电泳位置与理论预测位置连一直线,即为该蛋白的矢量,如果一个蛋白有多个矢量,表明该蛋白可能有多个翻译后修饰。4 展望自22DE应用于蛋白组的研究以来,尚无其它技术可以完全取代它。在过去的十年中,IPG2Dalt系统已经进行了较大的改进,如分离极碱蛋白的IPG胶其pH可达12;应用极窄pH胶条提高分辨率;已有商业化的IPG胶条出售;部分过程如灌制、展开、染色已经自动化。但人们渴望得到的22DE应该是:分辨率能不断提高;能够分离极端酸性、极端碱性、难溶、大分子量蛋白和膜蛋白;能够从大量的管家蛋白中分离出含量较低的蛋白;操作过程简单,最好自动化;对蛋白质的定量分析灵敏、快速、准确、经济实用。有理由相信,在不远的将来22DE技术会日臻完善并满足上述要求。参 考 文 献01 SmithiesO,PoulikMD.Two2dimensionalelectrophoresisofserumpro2teins[J].Nature,1956,177:1033.02 KloseJ,KobalzU.Two2dimensionalelectrophoresisofproteins:anup2datedprotocolandimplicationsforafunctionalanalysisofthegenome[J].Electrophoresis,1995,16:1034-1059.03 Humphery2SmithI,BlackstockW.Proteomeanalysis:genomicsviatheoutputratherthantheinputcode[J].JProtChem,1997,16(5):537-544.04 G&orgA,ObermaierC,BoguthG,etal.Thecurrentstateoftwo2dimen2sionalelectrophoresiswithimmobilizedpHgradients[J].Electrophore2198

第2期国外医学#生理、病理科学与临床分册 第22卷

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蛋白质双向电泳的基本原理(一)

蛋白质双向电泳的基本原理(一)

蛋白质双向电泳的基本原理(一)蛋白质双向电泳的基本原理蛋白质双向电泳是一种常用的分离和分析蛋白质的技术方法。

它通过利用蛋白质在电场中移动的特性，结合两个方向的电场，实现对复杂蛋白质混合物的分离和鉴定。

下面将从浅入深地解释蛋白质双向电泳的基本原理。

1. 电泳的基本原理电泳是一种基于物质在电场中迁移的原理，将带电粒子或分子分离开的技术。

在电泳过程中，带电的蛋白质分子会受到电场的作用力而移动，移动的速度与其电荷大小和分子质量有关。

2. 单向电泳的局限性在传统的单向电泳中，蛋白质样品被施加一个方向的电场，使得蛋白质分子按一维的方向进行迁移。

然而，由于蛋白质复杂性和电泳条件的限制，单向电泳难以有效地分离复杂的蛋白质混合物。

3. 双向电泳的优势双向电泳是为了克服单向电泳的局限性，实现更好的分离效果而发展起来的一种电泳技术。

它利用两个方向的电场交替施加，使得蛋白质分子在水平和垂直方向上均发生迁移，从而实现更高分辨率的蛋白质分离。

4. 蛋白质双向电泳的操作步骤•第一维电泳：将蛋白质样品在一个细长的电泳槽中垂直施加电场，使得蛋白质在水平方向上移动。

一般使用等电聚焦（IEF）技术，根据蛋白质的等电点来完成分离。

•电泳缓冲：在第一维电泳过程中，需要使用特定的电泳缓冲液，以确保蛋白质在移动过程中维持稳定的电荷状态。

•Gel转移：第一维电泳后，将蛋白质分离到一根细长的凝胶条上，凝胶条上有各种不同pH值的缓冲液。

•第二维电泳：将凝胶条垂直放置在另一个电泳槽中，施加另一个方向的电场。

凝胶条上的蛋白质会在垂直方向上继续移动，最终得到更高分辨率的蛋白质分离结果。

5. 蛋白质双向电泳的应用蛋白质双向电泳在生物医学和生命科学研究中得到广泛应用。

它被用于分离和鉴定复杂蛋白质混合物，寻找新的蛋白质标记物或生物标志物，研究蛋白质的功能和相互作用等。

6. 结论蛋白质双向电泳是一种重要的分离和鉴定蛋白质的技术方法，通过结合两个方向的电场，实现对复杂蛋白质混合物的高效分离。

蛋白质双向电泳简介

蛋白质双向电泳简介


IPG 胶的水合及上样
2-DE 样品
水合溶液
IPG 胶条支架
水合溶液：
8M
尿素
2%
NP-40 或 CHAPS
2%
IPG缓冲液 (两亲性电解液)
0.28% DTT
微量 溴酚蓝
IPG 胶条 定位
水合目的：使样品能完全以可溶形式进入IPG胶条内
蛋白载样量
IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：
待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度 样品的复杂度
IPG 胶条的平衡
平衡液 6 M 尿素和30% 甘油 减少电内渗
SDS-PAGE均一胶各成分用量
双向电泳（2DE）示意图
等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离
提取的总蛋 白溶液
大 分子量
SDS-PAGE 分离，使得 蛋白质按分 子量大小排 序
小
通过双向电泳使得不同等电点和分子量的 蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同
位置从而实现蛋白质的双向分离
步骤
样品制备 胶条水合 等电聚焦 聚焦后胶条平衡 第二相SDS-PAGE 分离蛋白质的检测与匹配分析
通过细胞破碎方法从原材料中提取粗蛋白质, 然后用含变性剂(或离液剂)、去污剂和还原剂 的裂解液溶解蛋白并使其变性。提取的蛋白可 用裂解液稀释。裂解液也可结合IPG胶条上基 质以维持IEF期间的蛋白质的稳定性。变性剂 尿素和硫脲与IEF兼容。用高浓度的变性剂以 打断蛋白质样品中的氢键结构。使用非离子型 或两性去污剂以破坏疏水交互作用。
在蛋白样品裂解时,应以溶解尽可能多的蛋白 质和保持在整个双向电泳过程中蛋白质的溶解 性为主要目标。根据目前的实践经验,蛋白质 变性成为多肽链便于多肽序列能够与其相应基
因序列匹配。二次样品制备的目的是去除干扰 双向电泳的非蛋白物质(如盐、酚类物质、脂 类、多糖和核酸等)和阻止在双向电泳谱中导 致假点的多肽或蛋白修饰。此外,用于样品制 备的药剂必须与等电聚焦兼容。
双向电泳技术

双向电泳技术

另一端的R基团为弱酸或弱碱性的缓冲基团，利用缓冲体系滴定终点附近一段
pH范围就可形成近似线性的分布在pH3～10范围的缓冲体系。
所以固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的区别在于前者的分子不是两
性分子，在凝胶聚合时候便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改变，
后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成pH梯度。
2.优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可
测定蛋白或多肽的等电点。
3.缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋
白。
20
第20页，本讲稿共67页
利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，在一个
稳定的、连续的、线性的（或非线性）pH梯度中进行蛋
白质的分离和分析。分析对象只限于蛋白质和其他两性分
子。
根据建立pH梯度原理不同，可分为载体两性电解质pH
梯度（carrier ampholyte pH gradient)和固相pH梯度
(immobilized pH gradient, IPG)。
21
第21页，本讲稿共67页
一、基本原理
1、蛋白质的等电点：取决于其氨基酸的组成。
组成每一种蛋白质或多肽的氨基酸的数目和比例是不同的，故蛋
，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子
可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。
4
第4页，本讲稿共67页
二、影响电泳速度的因素
1、电场强度；2、缓冲溶液的pH；3、缓冲溶液的离子强度；4、电渗；5、焦
耳热
三、电泳的分类
按原理分类：
自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行
电流降到最小切恒定时尽快结束IEF;
6第四节 双向电泳(2DGE)-生化分析

6第四节 双向电泳(2DGE)-生化分析

• 双向电泳根据其第一向电泳使用的介质的不同可以分为两类， • 一类是ISO-Dalt(等电点—道尔顿)，是用载体两性电解质配制成 的聚焦凝胶系统； • 另一类是IPG-Dalt(固相pH—道尔顿)，是将载体两性电解质偶联 在凝胶上的聚焦系统。
二、 双向电泳技术
1．ISO-Dalt系统 向将不同pI的蛋白质通过等电聚焦电泳分离，获
得了按等电点差异分离的蛋白质组分，然后再经 SDS-PAGE，将等电点相同或相近的、相对分子质 量有差异的蛋白质组分分开，最终得到不同相对分 子质量的蛋白质组分。
一般情况细胞内同时具有pI和相对分子质量都相同的 蛋白质，其概率是非常少的。所以，双向电泳得到的蛋白 质组分绝大部分都是单一组分。
2．IPG-Dalt系统 原理：固相pH介质是丙烯酰胺的衍生物，通过化学 方法以共价键的形式结合到聚丙烯酰胺凝胶上。pH 梯度在凝胶聚合时就已经形成，所以，该pH梯度不 受脱水、重新水化和电场等因素的影响，能得到很 稳定的pH梯度，不会产生pH漂移，电泳时不同pI的 蛋白质，根据其pI聚焦在相应的位置。
5 000～8 000多种蛋白质，这是其他任何分析鉴定技 术无法与其相比的。所以，双向电泳在样品的全组分 鉴定中占有重要的地位。
1970年Kaltschimidt 和Wittmann提出了用双向电 泳技术分离有效组分的研究。 双向电泳(two-dimensional electrophoresis，简称 2DE)分离技术是将样品进行一次电泳后，再沿它 的直角方向进行一次电泳。 随着双向电泳第一向的等电聚焦技术的发展，等 电聚焦形成的pH梯度有载体两性电解质pH梯度、 固相pH梯度及二者的“杂交”技术形成的pH梯 度。这些技术被引入双向电泳中以后，大大提高 了双向电泳的分辨率和重复性。