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蛋白质修饰位点预测
蛋白质修饰位点预测是生物信息学领域的一个重要研究方向。
蛋白质修饰是一种在蛋白质翻译后发生的化学变化，对蛋白质的功能和活性产生重要影响。
目前，许多生物信息学方法已经被开发用于预测蛋白质修饰位点，主要包括以下几种：
1. 基于机器学习的方法：这类方法通过训练一个分类器（如支持向量机（SVM）、神经网络等）来预测蛋白质修饰位点。
这类方法通常需要大量的已知修饰位点和非修饰位点的蛋白质序列作为训练数据。
例如，研究人员针对水稻蛋白质磷酸化位点开发了一种基于SVM的预测工具[1]。
2. 基于氨基酸序列特征的方法：这类方法通过分析蛋白质序列中的氨基酸特征（如氨基酸频率、组成等）来预测修饰位点。
这类方法不需要依赖蛋白质结构信息，仅通过序列信息进行预测。
例如，研究人员利用氨基酸频率计算方法来进行特征提取，并结合SVM算法构建了一种针对水稻蛋白质磷酸化位点的预测工具[2]。
3. 基于结构的方法：这类方法通过分析蛋白质三维结构来预测修饰位点。
由于蛋白质结构与功能密切相关，这类方法具有较高的预测准确性。
然而，结构信息通常不易获取，且计算成本较高。
4. 集成学习方法：这类方法将多个预测模型进行集成，以提高预测准确性。
例如，研究人员将多个基于机器学习的预测模型进行集成，构建了一种针对蛋白质翻译后修饰位点的预测工具[3]。
总之，蛋白质修饰位点预测是一个具有挑战性的课题。
随着生物信息学技术的发展，未来可能会出现更多高效、准确的预测方法。
同时，蛋白质修饰位点预测在生物学研究中的应用也将越来越广泛，有助于揭示蛋白质功能和调控机制。
ie、db抗原表位在科学研究领域中，抗原表位是指能够与免疫系统中的抗体或T细胞受体结合的特定区域。
在这个主题下，我们将讨论IE和DB两种抗原表位的重要性和研究进展。
下面将从抗原表位的定义、IE抗原表位的研究和DB抗原表位的研究三个方面来展开论述。
抗原表位是指能够被抗体或T细胞受体识别并结合的特定区域，也称为免疫表位。
抗原表位通常负责诱导免疫系统产生针对特定抗原的免疫应答。
抗原表位可以是蛋白质、多肽、糖类、核酸等生物分子的一部分，其结构决定了是否能够与免疫系统中的免疫分子结合。
研究抗原表位有助于我们更好地理解免疫系统的功能和机制，并为疫苗研发以及免疫诊断和治疗提供理论依据。
一、IE抗原表位的研究IE抗原表位指的是能够与IE抗体结合的特定区域。
IE抗原表位在病毒感染和免疫应答中起着重要作用。
研究人员通过使用不同的方法，如免疫沉淀、质谱分析和生物信息学等，成功地鉴定出多个IE抗原表位。
这些研究成果为了解病毒感染的机制以及开发相关疫苗提供了重要依据。
二、DB抗原表位的研究DB抗原表位指的是与DB抗体结合的特定区域。
DB抗体在自身免疫性疾病的发生和免疫调节中扮演着重要角色。
随着人们对自身免疫性疾病的研究深入，DB抗原表位的研究也越来越受到关注。
通过使用免疫学实验和分子生物学技术，研究人员已经鉴定出多个与DB抗体结合的抗原表位。
这些研究有助于我们更好地理解自身免疫性疾病的免疫机制，并为疾病的早期诊断和治疗提供理论基础。
三、IE和DB抗原表位的重要性和研究进展IE和DB抗原表位的研究对于免疫系统的功能和疾病的防治具有重要意义。
通过深入研究IE和DB抗原表位，可以揭示不同病原体和免疫相关疾病的抗原表位特征，为相关疫苗的设计和开发提供指导。
同时，IE和DB抗原表位的研究也为免疫诊断和治疗提供了新的思路和方法。
近年来，随着生物技术和研究方法的不断发展，IE和DB抗原表位的研究也取得了许多重要进展。
通过结合分子生物学、免疫学和生物信息学等技术手段，研究人员可以更精确、快速地鉴定出抗原表位。
蛋白质位点鉴定是指确定蛋白质分子中特定化学基团或氨基酸残基的位置。
以下是一些常用的蛋白质位点鉴定方法：
1. 质谱法：质谱法是一种常用的蛋白质鉴定方法，可以确定蛋白质的分子量、氨基酸序列以及修饰位点等信息。
其中，质谱肽谱技术可以通过测量蛋白质酶解产生的肽段质量，确定蛋白质的氨基酸序列和修饰位点。
2. 核磁共振光谱法：核磁共振光谱法可以提供蛋白质分子中原子的化学环境和空间结构信息，从而确定蛋白质的修饰位点。
3. 抗体结合法：利用特异性抗体与蛋白质上的特定表位结合，通过检测抗体与蛋白质的结合情况，可以确定蛋白质的修饰位点。
4. 蛋白质组学技术：蛋白质组学技术可以同时分析大量蛋白质，包括蛋白质的表达量、修饰情况和相互作用等。
其中，质谱蛋白质组学技术可以用于鉴定蛋白质的修饰位点。
5. 生物信息学分析：通过生物信息学分析，可以预测蛋白质的结构和功能，从而推测可能的修饰位点。
这些方法各有优缺点，需要根据具体情况选择合适的方法进行蛋白质位点鉴定。
抗体引物设计摘要：一、抗体引物设计概述二、抗体引物设计的重要性三、抗体引物设计的方法与步骤四、抗体引物设计的应用领域五、抗体引物设计的未来发展六、总结正文：抗体引物设计是生物医学研究中的重要环节，它对于研究抗体结构和功能、筛选特定抗体以及研究抗体与其靶标的相互作用具有重要意义。
本文将详细介绍抗体引物设计的方法、应用领域以及未来发展。
一、抗体引物设计概述抗体引物设计是指根据抗体可变区（V区）的序列信息，预测并合成一段具有抗原识别功能的抗原结合片段（抗原结合域），该片段可用于筛选具有特定表位的抗体。
抗原结合域的设计依赖于对抗体结构和功能的深入了解，以及生物信息学技术的应用。
二、抗体引物设计的重要性抗体引物设计在抗体药物研发、疫苗制备以及诊断试剂开发等领域具有广泛应用。
通过抗体引物设计，可以有针对性地筛选出具有特定功能的抗体，为疾病治疗、预防以及诊断提供重要依据。
三、抗体引物设计的方法与步骤1.获取抗体序列：从已知抗体库或数据库中获取抗体可变区的序列信息。
2.分析抗体序列：对抗体序列进行生物信息学分析，包括抗原表位预测、抗体结构预测等。
3.设计抗原结合域：根据分析结果，设计一段具有抗原识别功能的抗原结合域。
4.合成与筛选：将设计的抗原结合域合成出来，并对其进行筛选，以确定具有最佳抗原结合能力的候选抗体。
四、抗体引物设计的应用领域1.抗体药物研发：通过抗体引物设计，筛选出具有特定表位的抗体，用于治疗或预防疾病。
2.疫苗制备：利用抗体引物设计技术，筛选出能诱导保护性免疫应答的抗原表位，为疫苗研发提供依据。
3.诊断试剂开发：通过抗体引物设计，筛选出具有特异性的抗原结合抗体，用于疾病诊断。
五、抗体引物设计的未来发展随着生物信息学技术的不断发展，抗体引物设计将更加精确和高效。
人工智能和深度学习等技术的应用，有望提高抗体引物设计的预测准确率，为抗体研究和应用带来更多突破。
六、总结抗体引物设计在生物医学领域具有重要意义。
第一章绪言生物信息学的主要信息载体：DNA和蛋白质生物主要的遗传物质DNA生物的物质基础蛋白质一、生物信息学概述1、定义生物信息学（Bioinformatics）是生命科学、现代信息科学、数学、物理学以及化学等多个学科交叉结合形成的一门学科，是利用信息技术和数学方法对生命科学研究中的生物学数据进行存储、检索和分析的科学。
2、特点⁕以计算机为主要工具，以大量生物数据库和分析软件为基础⁕依赖于Internet⁕为人类揭示生命的奥秘提供了一条新的途径二、生物信息学的发展前基因组时代——生物数据库的建立、检索工具的开发、DNA和蛋白质序列分析、全局和局部的序列对位排列基因组时代——基因寻找和识别、网络数据库系统的建立、交互界面的开发后基因组时代——大规模基因组分析、蛋白质组分析三、生物信息学应用基础研究和教学：分子生物学研究的重要手段之一；生命科学的教学药物开发：新药筛选、药靶设计、分子药理学研究疾病诊断：利用疑难病症的病原DNA序列诊断疾病；遗传病的筛查其他：环境监测；食品安全检测；海关检测第二章数据库及其检索生物信息学数据库的建立及定义生物信息数据库：生物分子数据、分子结构结构及功能等实验证据一级数据库是直接来源于实验室获得的数据，即DNA和蛋白质数据库（X）在生物信息学中数据库查询是指对数据库中的注释信息进行基于关键词匹配查找，而数据库检索是指通过特定的序列相似性比对算法，在核酸或蛋白质序列数据库中获得序列信息（√）一、数据库定义数据库（database）是一类用于存储和管理数据的计算机文档，是统一管理的相关数据的集合，其存储形式有利于数据信息的检索与调用。
数据库的每一条记录（record）,也可以称为条目（entry），包含了多个描述某一类型数据特性或属性的字段（field），如基因名、来源物种、序列的创建日期等；值（value）则是指每条记录中某个字段的具体内容。
二、生物信息数据库的分类（1）按照数据来源一级数据库：数据直接来源于实验获得的原始数据，只经过简单的归类整理和注释二级数据库：对原始生物分子数据进行整理、分类的结果，是在一级数据库、实验数据和理论分析的基础上针对特定的应用目标而建立的。
bli检测抗原表位竞争实验流程
Bli检测抗原表位竞争实验是一项重要的生物技术，用于对抗体对多种不同的抗原表位的竞争能力进行分析。
以下是该实验的详细流程：
1. 确定抗原表位数量：首先，需要确定要测定的抗原表位数目。
这个步骤通常通过生物信息学分析和结构筛选方法实现。
2. 制备抗体和抗原：制备每个表位的抗体和相应的抗原。
这些抗原应包含所需的所有突变位点。
3. 建立竞争ELISA实验：选择适当的ELISA实验方法，利用每个表位的抗原进行竞争性ELISA实验。
在这些实验中，抗体将同时暴露于多种不同的互不竞争的表位上。
4. 分析ELISA实验：记录每个抗体对每个表位的亲和力值和抗原表位的竞争情况。
5. 统计分析：将ELISA实验的结果进行统计学分析，包括对不同表位之间的互竞争程度的评估以及抗体对它们的相对亲和力值的比较。
总结：
Bli检测抗原表位竞争实验是一种适用于研究不同抗原表位之间的互竞争程度和抗体对它们的相对亲和力值的重要生物技术。
通过利用竞争ELISA实验和统计分析，这种技术可以提供有关多种不同抗原表位之间竞争程度的详细信息，为研究人员提供了一个了解抗原抗体相互作用的有力工具。
动物医学进展,2010,31(12):87-91Pr ogress in Veterinary Medicine抗原表位研究方法进展宋 帅,李春玲*,贾爱卿,杨冬霞,李 淼(广东省农业科学院兽医研究所 广东省兽医公共卫生实验室,广东广州510640)收稿日期:2010-05-18基金项目:广东省农业攻关项目(2007A020300005-11)作者简介:宋 帅(1982-),男,河南汝州人,研究实习员,硕士,主要从事动物疫病及综合防控技术研究。
*通讯作者摘 要:抗原表位是抗原分子中的主要功能单位,能有效刺激机体的细胞免疫和体液免疫。
随着免疫学和生物信息学技术的不断发展,用于研究T 细胞表位和B 细胞表位的方法得到了很大的提高。
论文中概述了近几年用于研究T 细胞表位的预测方法和鉴定方法,以及在B 细胞表位研究中所用的表位肽扫描技术、蛋白质/切割0法、噬菌体展示技术、X -衍射与核磁共振、表位预测方法等技术,并对每种研究方法进行了比较,为从事抗原表位研究的人员提供参考,从而更有利于表位肽疫苗的研制和诊断方法的建立。
关键词:T 细胞表位;B 细胞表位;预测;鉴定中图分类号:S852.4文献标识码:A文章编号:1007-5038(2010)12-0087-05抗原表位又称抗原决定簇,是指抗原分子表面具有特殊结构和免疫活性的化学基团,具有刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能够被其识别的一个免疫活性区。
根据抗原表位特异性免疫应答的程度,可将抗原表位分为免疫优势表位、亚优势表位和隐性表位。
根据与抗原受体结合细胞的不同,分为B 细胞抗原表位和T 细胞抗原表位;其中B 细胞抗原表位则往往为亲水性肽段,一般位于抗原三维大分子的氨基酸长链折叠处[1],而T 细胞抗原表位往往仅为埋藏在蛋白质空间结构内部的疏水性肽段[2]。
根据表位对机体的影响,可分为保护性表位(免疫位)、致病性表位(变应位)和耐受性表位(耐受位)。
按抗原表位结构的不同分为连续性抗原表位和非连续性抗原表位,前者又称线型表位,是由肽链上顺序连续的氨基酸组成,后者又称构象型表位,是由那些空间邻近但顺序上不连续的氨基酸组成。
抗原表位设计及其在疫苗研发中的应用随着科技的不断发展，医疗健康方面的研究也在不断深入。
疫苗研究和疾病预防尤其备受关注。
在疫苗研发中，抗原表位设计技术被广泛应用，成为疫苗研究的重要一环。
抗原表位是指抗原分子上能够与免疫系统中抗体或者T细胞受体结合的特定区域。
这些区域具有高度特异性和免疫原性，是疫苗研究中的关键点。
抗原表位设计是指利用分子生物学、生物信息学和结构生物学等手段来寻找和设计具有免疫原性的抗原表位。
这项技术可以大大提高疫苗的免疫原性，从而提升疫苗的质量和效果。
在抗原表位设计中，主要包括以下几个步骤：首先，通过生物信息学手段对抗原分子进行分析，确定抗原表位的位置和特征；其次，通过分子生物学技术构建和表达含有抗原表位的重组抗原蛋白；最后，通过动物实验和临床试验验证疫苗的免疫原性和保护效果。
目前，抗原表位设计技术主要应用于疫苗研究中。
例如，在研究流感病毒疫苗时，通过抗原表位设计可以针对流感病毒上的表位进行分析，并根据不同流感毒株的表位差异设计出更具有免疫原性的疫苗。
此外，抗原表位设计也被应用于艾滋病、乙肝等疫苗的研究中，并取得了一定的进展。
除了在疫苗研究中的应用，抗原表位设计技术还有其他潜在的应用。
例如，在药物研发中，利用抗原表位设计技术，可以设计出更具有特异性和选择性的药物分子，从而提高药物疗效和降低不良反应；在医疗诊断中，利用抗原表位设计技术，可以设计出更为敏感和特异的检测试剂盒，从而提高诊断的准确性和精度。
总的来说，抗原表位设计技术在疫苗研究中发挥了重要作用，为疫苗的研发和推广提供了有力支持。
随着人们对健康和疾病预防的重视，抗原表位设计技术也将得到更多的应用。
未来，科技的不断发展将会进一步推动抗原表位设计技术的发展和应用，为人类健康事业做出更大的贡献。
李渊源，孙琦，杨齐，等．非洲猪瘟病毒Ｔ㊁Ｂ细胞表位的免疫信息学预测与分析［Ｊ］．畜牧与兽医，２０２４，５６（５）：９９－１０６．ＬＩＹＹ，ＳＵＮＱ，ＹＡＮＧＱ，ｅｔａｌ．ＩｍｍｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄｏｎＴ－ｃｅｌｌａｎｄＢ－ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓｉｎｔｈｅＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ＆ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０２４，５６（５）：９９－１０６．非洲猪瘟病毒Ｔ㊁Ｂ细胞表位的免疫信息学预测与分析李渊源１，孙琦１，杨齐２，黄转青１，张莹１，徐风华１∗（１．解放军总医院医疗保障中心药剂科药学基础研究室，北京㊀１００８５３；２．解放军总医院医疗保障中心药剂科药品保障室，北京㊀１００８５３）摘要：旨在通过免疫信息学方法预测非洲猪瘟病毒（ＡＳＦＶ）结构蛋白的Ｔ㊁Ｂ细胞表位，为非洲猪瘟（ＡＳＦ）表位疫苗的设计研制提供参考㊂从ＮＣＢＩ和ＲＣＳＢ数据库获取ＡＳＦＶ蛋白质序列和三维结构，利用ＩＥＤＢ㊁ＤＴＵＨｅａｌｔｈＴｅｃｈ等数据库的生物信息学工具对ＡＳＦＶ的５种结构蛋白ｐ７２㊁ｐ１７㊁ｐ４９㊁Ｍ１２４９Ｌ和Ｈ２４０Ｒ的细胞毒性Ｔ细胞表位㊁线性Ｂ细胞和构象Ｂ细胞表位进行鉴定㊂结果显示：５种蛋白质均为亲水性，二级结构以无规则卷曲为主，仅Ｍ１２４９Ｌ例外；预测到抗原性良好㊁无毒㊁无致敏的细胞毒性Ｔ细胞优势表位２７个，线性Ｂ细胞优势表位３５个；预测到仅针对ｐ７２的构象Ｂ细胞优势表位２个㊂结论：ＡＳＦＶ的５种蛋白质可能具有多个潜在Ｔ㊁Ｂ细胞表位，其中Ｂ细胞表位相对占优，５种蛋白质中ｐ７２和Ｍ１２４９Ｌ最具疫苗研发前景，可结合蛋白质相关参数信息为构建ＡＳＦ表位疫苗提供参考㊂关键词：非洲猪瘟病毒；预测；表位；Ｔ细胞；Ｂ细胞；免疫信息学中图分类号：Ｓ８５２．４㊀㊀㊀文献标志码：Ａ㊀㊀㊀文章编号：０５２９－５１３０（２０２４）０５－００９９－０８ＩｍｍｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄｏｎＴ－ｃｅｌｌａｎｄＢ－ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓｉｎｔｈｅＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓＬＩＹｕａｎｙｕａｎ１，ＳＵＮＱｉ１，ＹＡＮＧＱｉ２，ＨＵＡＮＧＺｈｕａｎｑｉｎｇ１，ＺＨＡＮＧＹｉｎｇ１，ＸＵＦｅｎｇｈｕａ１∗（１．ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｖｉｓｉｏｎ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＭｅｄｉｃａｌＳｕｐｐｌｉｅｓＣｅｎｔｅｒ，ＰＬＡＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５３，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｒｕｇＳｕｐｐｌｉｅｓＤｉｖｉｓｉｏｎ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＭｅｄｉｃａｌＳｕｐｐｌｉｅｓＣｅｎｔｅｒ，ＰＬＡＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｐｒｅｄｉｃｔｔｈｅＴ－ｃｅｌｌａｎｄＢ－ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ（ＡＳＦＶ）ｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｉｍｍｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｄｅｓｉｇｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＡＳＦｅｐｉｔｏｐｅｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｔｈｅｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＡＳＦＶｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｓｅａｒｃｈｉｎｇＮＣＢＩａｎｄＲＣＳＢｄａｔａｂａｓｅｓ．ＴｈｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ－ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓ，ｌｉｎｅａｒＢ－ｃｅｌｌ，ａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌＢ－ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓｏｆｔｈｅｆｉｖｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌＡＳＦＶｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐ７２，ｐ１７，ｐ４９，Ｍ１２４９Ｌ，ａｎｄＨ２４０Ｒ，ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｔｏｏｌｓｉｎＩＥＤＢ，ＤＴＵＨｅａｌｔｈＴｅｃｈａｎｄｏｔｈｅｒｄａｔａｂａｓｅｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｆｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅａｌｌｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｆｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｓｗａｓｍａｉｎｌｙｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ，ｅｘｃｅｐｔＭ１２４９Ｌ．２７ｐｏｔｅｎｔｉａｌｅｐｉｔｏｐｅｓｏｆｔｈｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌｓａｎｄ３５ｐｏｔｅｎｔｉａｌｅｐｉｔｏｐｅｓｏｆｔｈｅｌｉｎｅａｒＢｃｅｌｌｓｗｅｒｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄ，ｗｉｔｈｇｏｏｄａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ａｎｄｎｏａｌｌｅｒｇｅｎ．ＴｗｏｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌＢ－ｃｅｌｌｐｏｔｅｎｔｉａｌｅｐｉｔｏｐｅｓｏｎｌｙｆｒｏｍｐ７２ｗｅｒｅａｌｓｏｐｒｅｄｉｃｔｅｄ．ＴｈｅｆｉｖｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆＡＳＦＶｍｉｇｈｔｈａｖｅｍｕｌｔｉｐｌｅｐｏｔｅｎｔｉａｌＴ－ｃｅｌｌａｎｄＢ－ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓ，ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈＢ－ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓｗｅｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ．Ｉｎｔｈｅｆｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐ７２ａｎｄＭ１２４９Ｌｗｅｒｅｔｈｅｍｏｓｔｐｒｏｍｉｓｉｎｇｆｏｒｄｅｓｉｇｎｉｎｇａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏ⁃ｔｅｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｔｈｅａｎｔｉｇｅｎｅｐｉｔｏｐｅｓｍｉｇｈｔｂｅｕｓｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｒｅｓｅａｒｃｈｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＡＳＦｅｐｉｔｏｐｅｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ；ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ；ｅｐｉｔｏｐｅ；Ｔｃｅｌｌ；Ｂｃｅｌｌ；ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ㊀㊀非洲猪瘟病毒（Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ），一种在生猪之间传播的双链ＤＮＡ病毒，正二十面体球形对称结构，由外膜㊁蛋白质衣壳㊁脂质㊀收稿日期：２０２３－０３－０９；修回日期：２０２４－０３－１７基金项目：国家自然科学基金面上项目（８２１７１８１４）第一作者：李渊源，男，博士研究生∗通信作者：徐风华，研究员，主要从事药物新剂型和新型递药系统研发，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｆｈ＠３０１ｈｏｓｐｉｔａｌ ｃｏｍ ｃｎ㊂内膜㊁核壳㊁基因组５层结构组成，包含３万余个蛋白质亚基，其主要衣壳蛋白为结构蛋白ｐ７２［１］㊂其强毒力毒株对生猪致死率接近１００％，传染性强，致病性高，暂时没有特效药和商业化疫苗，一经发现必须立即扑杀生猪［２－３］，对于生猪以及养殖户来说，近乎 灭顶之灾 ㊂该疫情最早出现在非洲肯尼亚，于２０１８年传入我国，近１年的时间波及３１个省份，发病率最高可达３０ ４％，给我国的养猪业敲响了警钟［４－５］㊂研究人员已经先后尝试灭活疫苗㊁减毒活疫苗㊁ＤＮＡ疫苗㊁重组疫苗和亚单位疫苗等，但是均未完全成功㊂尽管ＡＳＦＶ的３Ｄ精细结构已经被破译，但是大多数ＡＳＦＶ基因功能尚未知晓，由于病毒的强变异性以及致弱毒株的生物安全隐患等问题限制了灭活以及减毒活疫苗的应用，针对ＡＳＦＶ的特效防护和及时控制依然任重而道远㊂表位亚单位疫苗通过利用病毒表面的抗原表位，诱发生猪产生免疫保护，本身不含病毒核酸，生物安全性更高，正逐渐获得研究人员的关注㊂抗原表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，Ｔ细胞表位作为线性表位，与主要组织抗原复合物（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）结合，并能被ＣＤ８＋（ＭＨＣ－Ⅰ）和ＣＤ４＋（ＭＨＣ－Ⅱ）Ｔ细胞受体识别［６］；Ｂ细胞表位则被Ｂ细胞表面受体或抗体特异性识别并结合，既包括线性表位，也有构象表位，位于抗原分子表面，激活后引起免疫应答，在疫苗研制㊁单克隆抗体和诊断试剂开发等方面扮演了重要角色㊂随着生物信息学技术的不断发展，依托免疫信息学工具预先对抗原蛋白质或基因信息进行严格的预测或筛选，挖掘和识别Ｔ㊁Ｂ细胞的表位序列，能够较大程度地提高抗原蛋白质中优势表位的发现效率，免疫信息学已成为表位预测分析不可或缺的工具，能够高效快速地筛选抗原蛋白序列中的候选表位，对研究设计表位疫苗具有重要意义［７－８］㊂本研究旨在揭示ＡＳＦＶ结构蛋白的Ｔ细胞和Ｂ细胞表位肽的生物学功能，探讨其抗原性，结合免疫信息学，从序列筛选和表位预测的角度，为ＡＳＦ疫苗的研发提供参考途径和可靠资料㊂１㊀材料与方法１ １㊀蛋白质序列和性质从美国国家生物信息中心以Ｆａｓｔａ格式获取ＡＳＦＶ分离株的基因组序列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／？ｔｅｒｍ＝ＡＳＦＶ），序列号：ＮＣ＿００１６５９ ２，检索其５种主要的结构蛋白，包括４种衣壳蛋白（ｐ７２㊁ｐ１７㊁ｐ４９和Ｍ１２４９Ｌ）和１种五邻体蛋白（Ｈ２４０Ｒ）［９］，使用ＥｘｐａｓｙＳｅｖｅｒ中在线分析工具ＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）分析每种蛋白的分子量㊁等电点㊁半衰期㊁稳定性㊁亲水性等理化性质，并使用ＰｒｏｔＳｃａｌｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）对蛋白质具体位置上氨基酸的亲／疏水情况进一步分析，相关参数选择默认值［１０］㊂１ ２㊀蛋白质二级结构预测分别使用ＳＯＰＭＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｎｐｓａ－ｐｒａｂｉ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ＮＰＳＡ／ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ．ｈｔｍｌ）和ＰＳＩＰＲＥＤ４．０（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆ．ｃｓ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｐｓｉｐｒｅｄ／）在线服务器预测分析５种蛋白质ｐ７２㊁ｐ１７㊁ｐ４９㊁Ｍ１２４９Ｌ和Ｈ２４０Ｒ的二级结构，包括α－螺旋㊁β－折叠㊁β－转角和无规则卷曲㊂１ ３㊀Ｔ细胞表位预测使用生物信息学工具ＮｅｔＭＨＣｐａｎ３ ０（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ／）和ＮｅｔＭＨＣｐａｎ４．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ．ｐｈｐ？ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．１）预测ｐ７２㊁ｐ１７㊁ｐ４９㊁Ｍ１２４９Ｌ和Ｈ２４０Ｒ这５种蛋白质中潜在的细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍ⁃ｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）表位［１１－１２］㊂选取７５个猪白细胞抗原（ｓｗｉｎｅｌｅｕｋｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ，ＳＬＡ）Ⅰ类等位基因，其中ＳＬＡ－１等位基因２３个，ＳＬＡ－２等位基因２６个，ＳＬＡ－３等位基因２１个，ＳＬＡ－６等位基因５个，设定肽段长度通常为８ １４个氨基酸，通过抗原肽与ＭＨＣ－Ⅰ类分子间结合力㊁结合蛋白酶体㊁抗原加工相关蛋白转运，以ＩＣ５０＜５００ｎｍ和亲和力预测分数排名前２％作为潜在多肽疫苗候选表位的评价标准㊂通过免疫表位数据库ＩＥＤＢ中ＭＨＣ－ⅠＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ工具（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ／）进一步考察候选表位的免疫原性，筛选免疫原性得分超过０ ２的表位作为ＣＴＬ表位的预测结果［１３］㊂结合ＳＯＰＭＡ或ＰＳＩＰＲＥＤ４ ０预测二级结构的结果，避开α－螺旋㊁β－折叠等较难作为表位的区域㊂１ ４㊀Ｂ细胞表位预测采用两种常用的连续／线性Ｂ淋巴细胞（ｌｉｎｅａｒＢｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＬＢＬ）表位预测工具ＡＢＣｐｒｅｄ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂｓ．ｉｉｉｔｄ．ｅｄｕ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ａｂｃｐｒｅｄ／ＡＢＣ＿ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ．ｈｔｍｌ）和Ｂｅｐｉｐｒｅｄ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｂｃｅｌｌ／）综合判断㊂设置ＡＢＣｐｒｅｄ服务器预测阈值为０ ８５，氨基酸肽段长度设置为１６［１４］㊂设置Ｂｅｐｉｐｒｅｄ２ ０预测阈值为０ ５，肽段长度为５ ３０个氨基酸［１５］㊂ＬＢＬ表位经上述两种预测工具筛选后，通过ｉＢＣＥ－ＥＬ预测服务器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｇｌｅｅｌａｂ．ｏｒｇ／ｉＢＣＥ－ＥＬ／）继续验证［１６］㊂从蛋白质资源数据库ＵｎｉＰｒｏｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）［１７］和ＲＣＳＢ蛋白质数据库（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／）［９］以ＰＤＢ格式获取ＡＳＦＶ中５种蛋白质（ｐ７２㊁ｐ１７㊁ｐ４９㊁Ｍ１２４９Ｌ和Ｈ２４０Ｒ）的三维结构信息㊂使用Ｄｉｓｃｏｔｏｐｅ２．０（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ．ｐｈｐ？ＤｉｓｃｏＴｏｐｅ－２．０）和ＥｌｌｉＰｒｏ（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｅｌｌｉｐｒｏ／）综合判断预测不连续／构象Ｂ淋巴细胞（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌＢｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＢＬ）表位㊂设置Ｄｉｓｃｏｔｏｐｅ２ ０鉴定阈值为１ ９［１８］㊂设置ＥｌｌｉＰｒｏ预测最低阈值为０ ５，不连续最大距离设置为６埃［１９］㊂１ ５㊀表位理化性质评价利用在线服务器Ｖａｘｉｇｅｎｖ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｇ－ｐｈａｒｍｆａｃ．ｎｅｔ／ｖａｘｉｊｅｎ／）进一步考察候选ＣＴＬ㊁ＬＢＬ表位的抗原性，设置Ｖａｘｉｇｅｎ服务器抗原性评价阈值为０ ４，选择目标微生物为病毒模型［２０］㊂为避免注射后的不良反应，针对已经筛选出的线性表位评价毒性和致敏性，毒性评价采用在线服务器ＴｏｘｉｎＰｒｅｄ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂｓ．ｉｉｉｔｄ．ｅｄｕ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｔｏｘｉｎｐｒｅｄ），设置毒性评价阈值为０［２１］㊂致敏性评价采用在线服务器Ａｌ⁃ｌｅｒＴＯＰｖ２ ０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｇ－ｐｈａｒｍｆａｃ．ｎｅｔ／Ａｌｌｅ⁃ｒＴＯＰ／）［２２］㊂２㊀结果与分析２ １㊀蛋白质序列和性质由ＮＣＢＩ数据库检索获得ｐ７２（ｐＢ６４６Ｌ）蛋白序列号为ＮＰ＿０４２７７５ １，ｐ１７（ｐＤ１１７Ｌ）蛋白序列号为ＮＰ＿０４２８００ １，ｐ４９（ｐＢ４３８Ｌ）蛋白序列号为ＮＰ＿０４２７６９ １，Ｍ１２４９Ｌ蛋白序列号为ＮＰ＿０４２７５４ １，Ｈ２４０Ｒ蛋白序列号为ＮＰ＿０４２８１２ １㊂通过ＰｒｏｔＰａｒａｍ对５种蛋白质的理化性质进行分析，Ｍ１２４９Ｌ的氨基酸数量最多，为１２４９个，其分子量㊁原子总数也是最多的；多数蛋白质结构被预测为不稳定，只有ｐ７２为稳定；５种蛋白质预测半衰期均超过１０ｈ，均为亲水性蛋白㊂使用ＰｒｏｔＳｃａｌｅ进一步对具体位置氨基酸的亲／疏水性进行预测，如图１所示，５种蛋白质中亲水性氨基酸占据相对多数㊂Ａ．ｐ７２；Ｂ．ｐ１７；Ｃ．ｐ４９；Ｄ．Ｍ１２４９Ｌ；Ｅ．Ｈ２４０Ｒ㊂图１㊀ＰｒｏｔＳｃａｌｅ预测５种蛋白质的亲／疏水性２ ２㊀蛋白质二级结构分析使用ＳＯＰＭＡ预测５种蛋白质的二级结构，包括α－螺旋㊁β－折叠㊁β－转角和无规则卷曲，５种蛋白质的二级结构中，除Ｍ１２４９Ｌ外，无规则卷曲占据多数，为４０％ ６０％，α－螺旋约２０％ ３０％（除了Ｍ１２４９Ｌ），β－折叠为０ ３０％，β－转角则低于１０％；在Ｍ１２４９Ｌ中，α－螺旋约５０％，无规则卷曲仅占２３％㊂使用ＰＳＩＰＲＥＤ４ ０预测５种蛋白质的二级结构，包括α－螺旋㊁β－折叠和无规则卷曲，除Ｍ１２４９Ｌ外，无规则卷曲依然占据多数，为４０％ ７０％，α－螺旋和β－折叠范围均较大，α－螺旋为０６０％，β－折叠为０ ５０％㊂两种预测方法分析５种蛋白质二级结构组成结果如表１所示，不论ＳＯＰＭＡ还是ＰＳＩＰＲＥＤ４ ０预测二级结构，不同于其他４种蛋白质以无规则卷曲为主，Ｍ１２４９Ｌ中α－螺旋占据多数，提示该蛋白质的二级结构可能比较稳定㊂表１㊀５种蛋白质二级结构组成蛋白质名称ＳＯＰＭＡＰＳＩＰＲＥＤ４ ０α－螺旋β－折叠β－转角无规则卷曲α－螺旋β－折叠无规则卷曲氨基酸数量占据比例／％氨基酸数量占据比例／％氨基酸数量占据比例／％氨基酸数量占据比例／％氨基酸数量占据比例／％氨基酸数量占据比例／％氨基酸数量占据比例／％ｐ７２１２５１９．３５１６３２５．２３３４５．２６３２４５０．１６６６１０．２２１５７２４．３０４２３６５．４８ｐ１７３５２９．９２２０１７．０９４３．４２５８４９．５７５５４７．０１５４．２７５７４８．７２ｐ４９１２８２９．２２３０６．８５３２７．３１２４８５６．６２１３２３０．１４１４３．２０２９２６６．６６Ｍ１２４９Ｌ６２０４９．６４２１３１７．０５１２４９．９３２９２２３．３８７１９５７．５７８７６．９６４４３３５．４７Ｈ２４０Ｒ５０２０．８３７２３０ ００１８７．５０１００４１．６７７２．９２１１６４８．３３１１７４８．７５２ ３㊀优势ＣＴＬ表位分析通过ＮｅｔＭＨＣｐａｎ３ ０和ＮｅｔＭＨＣｐａｎ４ １预测ＣＴＬ表位，得分越低，其成为优势表位可能性越大，消除冗余后，５种蛋白质ｐ７２㊁ｐ１７㊁ｐ４９㊁Ｍ１２４９Ｌ和Ｈ２４０Ｒ分别获得ＣＴＬ候选表位１０１㊁１４㊁５５㊁２６０㊁５８个，进一步使用ＭＨＣ－ⅠＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ评估免疫原性，选择得分超过０ ２的表位，同时除去二级结构中α－螺旋㊁β－折叠区域，５种蛋白质分别得到ＣＴＬ候选表位２９㊁５㊁３㊁５８㊁１２个㊂分别使用Ｖａｘｉｇｅｎｖ２ ０㊁ＴｏｘｉｎＰｒｅｄ㊁ＡｌｌｅｒＴＯＰｖ２ ０评价ＣＴＬ候选表位的抗原性㊁毒性和致敏性，筛选得到抗原性良好㊁无毒性㊁无致敏性的ＣＴＬ候选表位合计２７个，５种蛋白质分别为１２㊁０㊁０㊁１２㊁３个，其中３种蛋白质的序列㊁具体位置和各项评分如表２所示㊂表２㊀３种蛋白质优势ＣＴＬ表位预测结果蛋白质名称肽段序列长度／ａａ起始位置结束位置ＩＣ５０评分亲和力百分比免疫原性评分抗原性评分毒性致敏性ｐ７２ＡＭＭＩＴＦＡＬＫ９５７９５８７２３２．４１．１５６２０．２５１４６１．４５６２无无ＡＳＡＩＮＦＬＬＬ９６２７６３５３４９．９１．２１３２０．２３４６８０．７９４２无无ＫＬＴＦＧＩＰＱＹ９８９９７４２０．４０．１６８４０．２１１６４０．５４２０无无ＲＡＲＥＦＹＩＳＷ９６０２６１０１４８．４０．５７４１０．２４３７３１．５４３７无无ＲＲＮＩＲＦＫＰＷＦ１０３８８３９７４４９．５１．８９２１０．２１３２８１．６５３２无无ＳＡＳＡＩＮＦＬＬ９６２６６３４４７５．３０．３８９２０．２０１５００．６５５２无无ＳＡＳＡＩＮＦＬＬＬ１０６２６６３５３０３．０１．４２４９０．２０３３３０．８５９４无无ＳＱＩＥＥＴＨＬＶ９５０５８４７６．００ ０２７２０．２９８８１１．０８９６无无ＳＲＡＲＥＦＹＩＳＷ１０６０１６１０３３６．００．２８０００．２８８４６１．２２４２无无ＳＶＳＩＰＦＧＥＲ９３４７３５５２２７．８０．４５８２０．２６６７２１．５１２７无无ＳＶＳＩＰＦＧＥＲＦ１０３４７３５６４６７．００．３１８５０．３３００６０．８５０２无无ＶＳＩＰＦＧＥＲＦ９３４８３５６４０２．２０．８３２１０．２９２６８０．９５２１无无Ｍ１２４９ＬＡＳＬＥＦＮＴＦＹＡＦ１１９２２９３２３７７．１１．９２８００．３７２５９０．５２８９无无ＡＳＬＥＦＮＴＦＹＡＦＹ１２９２２９３３４０２．０３．０６６５０．４５４５９０．４６９３无无ＡＹＶＴＦＬＬＥＫ９６２０６２８４２１．５１．１６９８０．２０５１６０．４５４９无无ＦＬＴＩＴＩＨＧＭ９６０４６１２３６６．６１．０８４７０．３５６７００．５０５５无无ＩＳＰＡＶＩＥＡＩ９１０２９１０３７１４９．９１．７６９００．３０８６１０．７４９７无无ＫＡＣＴＦＩＨＦＧＫ１０５３５５４４２８２．８７．１６０００．４１４２１１．１０２２无无ＫＡＳＬＥＦＮＴＦＹＡＦＹ１３９２１９３３４１８．６８．９０８７０．３９００８０．４１０３无无ＫＥＦＬＴＩＴＩ８６０２６０９４３０．２０．２８６１０．２２２６８０．５６３７无无ＫＮＩＲＬＩＤＦＬＦ１０４３５２３９７．７１．９７２４０．３２７２８１．９３０２无无ＬＩＤＦＬＦＴＬＫ９４７５５４８０．７３．４８５１０．２５０６８１．７０９２无无ＲＥＦＡＬＴＥＬＮＴＩ１１１１６６１１７６２７２．５０．７２９００．２０８６５０．７９１９无无ＲＥＦＡＬＴＥＬＮＴＩＩ１２１１６６１１７７３８８．５１．６５４９０．２９５５００．５５０５无无蛋白质名称肽段序列长度／ａａ起始位置结束位置ＩＣ５０评分亲和力百分比免疫原性评分抗原性评分毒性致敏性Ｈ２４０ＲＫＭＴＶＦＰＦＭＩＰＦＰＬ１３６３７５４８２．７２４．５７９４０．３１１８２０．７６１６无无ＭＴＶＦＰＦＭＩＰＦＰＬ１２６４７５３４９．７１１．００６１０．２７４８８０．５４４７无无ＭＴＶＦＰＦＭＩＰＦＰＬＱＫ１４６４７７４０３．７１０．５６６３０．２０８７２０．５８９４无无２ ４㊀优势ＬＢＬ表位分析分别使用ＡＢＣｐｒｅｄ和Ｂｅｐｉｐｒｅｄ２ ０预测５种蛋白质ｐ７２㊁ｐ１７㊁ｐ４９㊁Ｍ１２４９Ｌ和Ｈ２４０Ｒ的ＬＢＬ表位，按预测阈值筛选表位，除去肽段长度少于５和多于３０的表位序列，５种蛋白质分别获得了ＬＢＬ候选表位３５㊁３㊁１８㊁６１㊁１３个，其预测得分平均值分别为０ ４９６㊁０ ５０１㊁０ ５５５㊁０ ４８９㊁０ ５０１，进一步使用ｉＢＣＥ－ＥＬ逐个验证，除去二级结构中较难形成表位的α－螺旋㊁β－折叠区域，５种蛋白质分别获得ＬＢＬ候选表位３４㊁３㊁１７㊁５６㊁１１个㊂分别使用Ｖａｘｉｇｅｎｖ２ ０㊁ＴｏｘｉｎＰｒｅｄ㊁ＡｌｌｅｒＴＯＰｖ２ ０评价ＬＢＬ候选表位的抗原性㊁毒性和致敏性，筛选得到抗原性良好㊁无㊁无致敏性的ＬＢＬ候选表位合计３５个，５种蛋白质分别为１０㊁１㊁５㊁１７㊁２个，其序列㊁具体位置和预测值如表３所示㊂表３㊀５种蛋白质优势ＬＢＬ表位预测结果蛋白质名称肽段序列长度／ａａ起始位置结束位置表位概率值抗原性评分毒性致敏性ｐ７２ＡＭＭＩＴＦＡＬＫＰＲＥＥＹＱＰ１６５７９５９４０．６６８６１．６１８９无无ＥＦＹＩＳＷＤＴＤＹＶＧＳＩＴＴ１６６０５６２００．９５６００．４０４６无无ＦＧＲＰＩＶＰＧＴＫＮＡＹＲＮＬ１６１６１１７６０．９４６１０．４５３５无无ＫＰＹＶＰＶＧＦＥＹＮＫＶＲＰＨＴＧＴＰＴＬＧＮＫＬ２６６５９００．３６０８０．４９０１无无ＰＦＧＲＰＩＶＰＧＴＫＮ１２１６０１７１０．９５６００．７７３７无无ＱＰＴＨＨＡＥＩＳＦＱＤＲＤＴＡＬＰＤＡＣＳＳＩＳＤＩＳＰ２９４９９５２７０．４５４５１．２７４０无无ＲＦＩＰＧＲＰＳＲＲＮＩＲＦＫＰ１６３８０３９５０．９５６０１．２２４４无无ＳＳＹＩＰＦＨＹＧＧＮＡＩＫＴＰ１６５５９５７４０．７７０００．５１５５无无ＴＷＮＩＳＤＱＮＰＨＱＨＲＤＷＨ１６４７３４８８０．９５６００．９６５６无无ＴＷＮＩＳＤＱＮＰＨＱＨＲＤＷＨＫ１７４７３４８９０．９５６００．５９９９无无ｐ１７ＥＰＨＨＨＦＰＶＦＦＲＫＲＫＮＳ１６８３９８０．９５６０１．０５１８无无ｐ４９ＧＧＩＧＤＳＫＬＤＳＴＦＰＫＤＦ１６３９１４０６０．８５１３０．６６２３无无ＧＩＡＧＲＧＩＰＬＧＮＰＨＶＫＰ１６２３１２４６０．９５６０１．４２７５无无ＫＬＤＳＴＦＰＫＤＦＮＡＳＳＶＰ１６３９７４１２０．９５６００．４５６９无无ＮＧＹＩＰＨＫＤＶＹＮＩＬＣＬＡ１６２０６２２１０．９５６００．７２２０无无ＴＧＶＰＭＬＧＰＬＰＰＫＤＳＱＨ１６２６０２７５０．９５６００．７５６４无无Ｍ１２４９ＬＡＥＬＩＴＴＥＹＬＮＩＫＫＱＷＥ１６３７９３９４０．９５６００．７３８２无无ＤＩＬＳＬＮＮＥＥＩＥＡ１２１６２７０．５８３７０．９７３２无无ＥＧＲＳＹＡＤＩＲＥＧＱＧＡＰＰ１６１０４１１０５６０．９５６００．８５７３无无ＥＩＧＳＦＳＰＥＴＬＧＹＶＡＳＧＡ１７１４７１６３０．９５６０１．０８６１无无ＥＳＬＲＶＷＷＧＧＲＤＥＥＫＴＳ１６７５９７７４０．９５６００．５３９１无无ＦＹＮＩＦＤＰＮＴＧＲＡＤＱＲＴ１６８２１８３６０．９５６００．４５８７无无ＧＡＭＥＧＲＳＹＡＤＩＲＥＧＱＧＡＰＰＰＰＴＳＭＤＤＰＲＬ２９１０３８１０６６０．７２４６０．７７７２无无ＨＡＥＱＲＥＫＥＱＭＩＬＱＱＶＤ１６３０６３２１０．８７４００．６９０４无无ＨＲＫＬＤＲＥＤＱＧＳＨＩＳＮＩ１６２２８２４３０．９５６００．６６８６无无ＨＲＫＬＤＲＥＤＱＧＳＨＩＳＮＩＶＥＴＥＥＩＥＰＥＥ２６２２８２５３０．３９２７０．７６５４无无ＩＨＱＮＧＬＱＧＬＳＶＱＤＤ１４６６０６７３０．５９５４０．５１５０无无蛋白质名称肽段序列长度／ａａ起始位置结束位置表位概率值抗原性评分毒性致敏性Ｍ１２４９ＬＩＱＩＫＫＤＭＴＴＰＳＳＥＴＱＰ１６９９１１００６０．９５６００．４２７５无无ＬＴＥＩＬＬＧＰＭＹＤＹＡＡＴＶ１６６７８６９３０．５６５５０．５０３５无无ＰＰＰＰＴＳＭＤＤＰＲＬＭＡＶＤ１６１０５５１０７００．９５６００．６８９６无无ＱＥＤＲＴＡＤＶＧ９５０８５１６０．９５６０１．６２５１无无ＴＭＫＡＣＴＦＩＨＦＧＫＬＶＤＶ１６５３３５４８０．９２８３０．７７１１无无ＶＶＰＩＶＳＥＫＫＫＥＬＲＶＲＰＳＴＲ１９８８１０６０．９５６０１．１７５８无无Ｈ２４０ＲＬＤＳＱＥＫＲＨＧＨＹＰＦＳＦＥＬＫＰＹＧＱＴＧＡ２５２５４９０．５４６８１．４６７７无无ＴＲＡＡＰＫＭＡＳＫＫＥＨＱ１４８２１０．９１９５０．９３３０无无２ ５㊀优势ＣＢＬ表位分析从ＵｎｉＰｒｏｔ数据库检索ＡＳＦＶ５种蛋白质ｐ７２㊁ｐ１７㊁ｐ４９㊁Ｍ１２４９Ｌ和Ｈ２４０Ｒ编号分别为Ｐ２２７７６㊁Ｑ８９４２４㊁Ｑ６５１６５㊁Ｑ６５１５２㊁Ｑ６５１９０，仅发现ｐ７２有可以获取的结构信息，其余４种蛋白质都还没有可以获得的结构信息㊂从ＲＣＳＢ数据库检索获得ｐ７２蛋白ｐｄｂ标识号６Ｌ２Ｔ，其３Ｄ结构如图２所示㊂通过Ｄｉｓｃｏｔｏｐｅ２ ０预测ｐ７２的ＣＢＬ表位，从１８８９个氨基酸中获得１８９个ＣＢＬ表位氨基酸，其中Ａ链６４个，Ｂ链６６个，Ｃ链５９个㊂通过ＥｌｌｉＰｒｏ预测ｐ７２的ＣＢＬ表位，得分越高，包含在球体模型内氨基酸残基越多，溶剂可溶性越强，成为候选表位可能性越大，ｐ７２获得ＣＢＬ优势表位２个，优势表位１包含１０７５个氨基酸残基，预测评分０ ６９８；优势表位２包含１０个氨基酸残基，预测评分０ ６４２，其氨基酸序列为Ｃ：Ｈ２８２，Ｃ：Ｐ２８４，Ｃ：Ｅ２８５，Ｃ：Ｎ２８６，Ｃ：Ｉ２８７，Ｃ：Ｑ２８８，Ｃ：Ｔ２８９，Ｃ：Ａ２９０，Ｃ：Ｇ２９１，Ｃ：Ｋ２９２，２个优势ＣＢＬ表位的３Ｄ结构映射如图３所示㊂图２㊀ＲＣＳＢ蛋白质ｐ７２的３Ｄ结构Ａ．ｐ７２优势ＣＢＬ表位１（１０７５个氨基酸残基）；Ｂ．ｐ７２优势ＣＢＬ表位２（１０个氨基酸残基）㊂图３㊀ＥｌｌｉＰｒｏ预测ｐ７２优势ＣＢＬ表位的３Ｄ结构映射３㊀讨论由于ＡＳＦＶ具有高传染性㊁高致死率和复杂的流行性［２３］，只靠扑杀生猪很难控制疫情传播，并且成本高㊁损失大，因此迫切需要一种安全㊁有效，可大规模应用的疫苗，控制疫情传播，减少经济损失㊂表位疫苗作为亚单位疫苗，以线性肽段为机体ＭＨＣ系统所识别，使机体产生保护性免疫应答，不仅突破了将整个基因作为目的片段的局限，同时因为表位片段较短㊁表达产物分子量较小，可以预留足够的空间插入合适的免疫增强因子，不存在基因整合以及重组等问题，相比于减毒活疫苗㊁ＤＮＡ疫苗更加安全，不会产生严重的副作用［２４］㊂本研究从免疫信息学的角度，筛选鉴定ＡＳＦＶ５种结构蛋白ｐ７２㊁ｐ１７㊁ｐ４９㊁Ｍ１２４９Ｌ和Ｈ２４０Ｒ的Ｔ㊁Ｂ细胞表位，作为构成ＡＳＦＶ二十面体结构的重要衣壳蛋白，参与病毒形态发生和基因转录，可诱导产生中和抗体，产生免疫应答［９，２５］㊂５种蛋白均为亲水性蛋白质，共获得ＣＴＬ优势表位２７个，ＬＢＬ优势表位３５个，仅针对ｐ７２的ＣＢＬ优势表位２个，其中５种蛋白质ＣＴＬ优势表位分别为１２（４４ ４４％）㊁０㊁０㊁１２（４４ ４４％）和３（１１ １１％）个，ＬＢＬ优势表位分别为１０（２８ ５７％）㊁１（２ ８６％）㊁５（１４ ２９％）㊁１７（４８ ５７％）和２（５ ７１）个㊂预测表位多数集中于ｐ７２和Ｍ１２４９Ｌ，合计占ＣＴＬ优势表位的８８ ８９％（２４／２７），ＬＢＬ优势表位的７７ １４％（２７／３５），以及ＣＢＬ优势表位的１００％（２／２），说明它们可被用作抗原性靶标，在５种蛋白质中最具疫苗设计研制前景［２６］㊂尽管Ｍ１２４９Ｌ二级结构以α－螺旋为主，但是其包含氨基酸数量较多，有足够的无规则卷曲区域可以用来筛选抗原表位㊂Ｔ细胞表位预测工具基于多肽片段与ＭＨＣ结合㊁细胞内加工和转运的过程，计算得到每个多肽作为Ｔ细胞表位的预测评分㊂人类白细胞抗原分为ＭＨＣ－Ⅰ类和ＭＨＣ－Ⅱ类，分别激活人体内ＣＴＬ和辅助Ｔ淋巴细胞（ｈｅｌｐｅｒＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＨＴＬ）㊂其中ＣＴＬ能够分泌颗粒酶㊁穿孔素等免疫因子中和被感染受损的宿主细胞，在ＭＨＣ－Ⅰ介导的细胞免疫中发挥关键作用㊂ＳＬＡ，即猪的ＭＨＣ抗原，分布于白细胞表面，能够识别Ｔ细胞表面的自身肽和非自身肽［２７］㊂Ｂ细胞表位分为ＬＢＬ表位和ＣＢＬ表位两种类型，ＬＢＬ表位由参与抗体结合的连续氨基酸线性延伸组成，其相互作用基于表位的一级结构，而ＣＢＬ表位由抗原蛋白序列上相距较远的氨基酸组成，通过折叠结构聚集在空间中［２８］㊂尽管预测Ｔ细胞表位相比于Ｂ细胞表位更加先进可靠［２９］，但是对于非人类蛋白的ＡＳＦＶ，Ｔ细胞表位预测可能更受限；对于ＡＳＦＶ的这５种蛋白质，筛选出的Ｂ细胞优势表位多于Ｔ细胞表位㊂通过预测ＡＳＦＶ的５种蛋白质的理化性质㊁二级结构等参数，得到多个潜在Ｔ㊁Ｂ细胞表位，能够诱导保护性免疫应答，预测准确性良好，尤其是蛋白ｐ７２和Ｍ１２４９Ｌ，为构建ＡＳＦ表位疫苗提供研究依据，为设计研发效果强㊁安全性高的ＡＳＦ疫苗提供潜在思路㊂参考文献：［１］㊀ＬＩＵＱ，ＭＡＢ，ＱＩＡＮＮ，ｅｔａｌ．ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｍａｊｏｒｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎｐ７２［Ｊ］．ＣｅｌｌＲｅｓ，２０１９，２９（１１）：９５３－９５５．［２］㊀ＧＡＬＩＮＤＯＩ，ＡＬＯＮＳＯＣ．Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ：ａｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１７，９（５）：１０３．［３］㊀王涛，孙元，罗玉子，等．非洲猪瘟防控及疫苗研发：挑战与对策［Ｊ］．生物工程学报，２０１８，３４（１２）：１９３１－１９４２．［４］㊀ＬＩＵＪ，ＬＩＵＢ，ＳＨＡＮＢ，ｅｔａｌ．ＰｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｉｎＣｈｉｎａ，２０１８－２０１９［Ｊ］．ＪＭｅｄＶｉｒｏｌ，２０２０，９２（８）：１０２３－１０３４．㊀［５］㊀ＺＨＯＵＸ，ＬＩＮ，ＬＵＯＹ，ｅｔａｌ．ＥｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｉｎＣｈｉｎａ，２０１８［Ｊ］．ＴｒａｎｓｂｏｕｎｄＥｍｅｒｇＤｉｓ，２０１８，６５（６）：１４８２－１４８４．㊀［６］㊀ＪＥＮＳＥＮＫＫ，ＡＮＤＲＥＡＴＴＡＭ，ＭＡＲＣＡＴＩＬＩＰ，ｅｔａｌ．ＩｍｐｒｏｖｅｄｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇａｆｆｉｎｉｔｙｔｏＭＨＣｃｌａｓｓＩＩｍｏｌｅ⁃ｃｕｌｅｓ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１８，１５４（３）：３９４－４０６．［７］㊀ＧＲＩＦＯＮＩＡ，ＳＩＤＮＥＹＪ，ＺＨＡＮＧＹ，ｅｔａｌ．ＡｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙａｎｄｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃａｐｐｒｏａｃｈｃａｎｐｒｅｄｉｃｔｃａｎｄｉｄａｔｅｔａｒｇｅｔｓｆｏｒｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２［Ｊ］．ＣｅｌｌＨｏｓｔＭｉｃｒｏｂｅ，２０２０，２７（４）：６７１－６８０．［８］㊀ＸＵＷ，ＷＡＮＧＭ，ＹＵＤ，ｅｔａｌ．ＶａｒｉａｔｉｏｎｓｉｎＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｓｐｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓａｎｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｓｄｕｒｉｎｇｇｌｏｂａｌｔｒａｎｓｍｉｓ⁃ｓｉｏｎｃｏｕｒｓｅｏｆＣＯＶＩＤ－１９［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ，２０２０，１１：５６５２７８．［９］㊀ＷＡＮＧＮ，ＺＨＡＯＤ，ＷＡＮＧＪ，ｅｔａｌ．ＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓａｎｄｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｖｉｒａｌａｓｓｅｍｂｌｙ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１９，３６６（６４６５）：６４０－６４４．［１０］ＷＩＬＫＩＮＳＭＲ，ＧＡＳＴＥＩＧＥＲＥ，ＢＡＩＲＯＣＨＡ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎｉｄｅｎ⁃ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｔｏｏｌｓｉｎｔｈｅＥｘＰＡＳｙｓｅｒｖｅｒ［Ｊ］．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ，１９９９，１１２：５３１－５５２．［１１］ＲＥＹＮＩＳＳＯＮＢ，ＡＬＶＡＲＥＺＢ，ＰＡＵＬＳ，ｅｔａｌ．ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４ １ａｎｄＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ－４ ０：ｉｍｐｒｏｖｅｄｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓｏｆＭＨＣａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓ⁃ｅｎｔａｔｉｏｎｂｙｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｍｏｔｉｆｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆＭＳＭＨＣｅｌｕｔｅｄｌｉｇａｎｄｄａｔａ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２０２０，４８（Ｗ１）：Ｗ４４９－Ｗ４５４．［１２］ＮＩＥＬＳＥＮＭ，ＡＮＤＲＥＡＴＴＡＭ．ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－３ ０；ｉｍｐｒｏｖｅｄｐｒｅ⁃ｄｉｃｔｉｏｎｏｆｂｉｎｄｉｎｇｔｏＭＨＣｃｌａｓｓＩｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｒｏｍｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｄｐｅｐｔｉｄｅｌｅｎｇｔｈｄａｔａｓｅｔｓ［Ｊ］．ＧｅｎｏｍｅＭｅｄ，２０１６，８（１）：３３．［１３］ＣＡＬＩＳＪＪ，ＭＡＹＢＥＮＯＭ，ＧＲＥＥＮＢＡＵＭＪＡ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＭＨＣｃｌａｓｓＩｐｒｅｓｅｎｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓｔｈａｔｅｎｈａｎｃｅｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ［Ｊ］．ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔＢｉｏｌ，２０１３，９（１０）：ｅ１００３２６６．［１４］ＳＡＨＡＳ，ＲＡＧＨＡＶＡＧＰ．ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓＢ－ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓｉｎａｎａｎｔｉｇｅｎｕｓｉｎｇｒｅｃｕｒｒｅｎｔｎｅｕｒａｌｎｅｔｗｏｒｋ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２００６，６５（１）：４０－４８．［１５］ＪＥＳＰＥＲＳＥＮＭＣ，ＰＥＴＥＲＳＢ，ＮＩＥＬＳＥＮＭ，ｅｔａｌ．ＢｅｐｉＰｒｅｄ－２ ０：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄＢ－ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇｃｏｎｆｏｒｍａ⁃ｔｉｏｎａｌｅｐｉｔｏｐｅｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２０１７，４５（Ｗ１）：Ｗ２４－Ｗ２９．㊀［１６］ＭＡＮＡＶＡＬＡＮＢ，ＧＯＶＩＮＤＡＲＡＪＲＧ，ＳＨＩＮＴＨ，ｅｔａｌ．ｉＢＣＥ－ＥＬ：ａｎｅｗｅｎｓｅｍｂｌｅｌｅａｒｎｉｎｇｆｒａｍｅｗｏｒｋｆｏｒｉｍｐｒｏｖｅｄｌｉｎｅａｒＢ－ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ，２０１８，９：１６９５．［１７］ＴｈｅＵｎｉＰｒｏｔＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．ＵｎｉＰｒｏｔ：ｔｈｅｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｏｔｅｉｎｋｎｏｗｌｅｄｇｅ⁃ｂａｓｅｉｎ２０２３［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２０２３，５１（Ｄ１）：Ｄ５２３－Ｄ５３１．㊀［１８］ＫＲＩＮＧＥＬＵＭＪＶ，ＬＵＮＤＥＧＡＡＲＤＣ，ＬＵＮＤＯ，ｅｔａｌ．ＲｅｌｉａｂｌｅＢｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ：ｉｍｐａｃｔｓｏｆｍｅｔｈｏｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄｂｅｎｃｈｍａｒｋｉｎｇ［Ｊ］．ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔＢｉｏｌ，２０１２，８（１２）：ｅ１００２８２９．［１９］ＰＯＮＯＭＡＲＥＮＫＯＪ，ＢＵＩＨＨ，ＬＩＷ，ｅｔａｌ．ＥｌｌｉＰｒｏ：ａｎｅｗｓｔｒｕｃ⁃ｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｅｐｉｔｏｐｅｓ［Ｊ］．ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００８，９：５１４．［２０］ＤＯＹＴＣＨＩＮＯＶＡＩＡ，ＦＬＯＷＥＲＤＲ．ＶａｘｉＪｅｎ：ａｓｅｒｖｅｒｆｏｒｐｒｅｄｉｃ⁃ｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｎｔｉｇｅｎｓ，ｔｕｍｏｕｒａｎｔｉｇｅｎｓａｎｄｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅｓ［Ｊ］．ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００７，８：４．［２１］ＧＵＰＴＡＳ，ＫＡＰＯＯＲＰ，ＣＨＡＵＤＨＡＲＹＫ，ｅｔａｌ．Ｉｎｓｉｌｉｃｏａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１３，８（９）：ｅ７３９５７．［２２］ＤＩＭＩＴＲＯＶＩ，ＢＡＮＧＯＶＩ，ＦＬＯＷＥＲＤＲ，ｅｔａｌ．ＡｌｌｅｒＴＯＰｖ ２：ａｓｅｒｖｅｒｆｏｒｉｎｓｉｌｉｃｏｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆａｌｌｅｒｇｅｎｓ［Ｊ］．ＪＭｏｌＭｏｄｅｌ，２０１４，２０（６）：２２７８．［２３］ＳÁＮＣＨＥＺ－ＣＯＲＤÓＮＰＪ，ＭＯＮＴＯＹＡＭ，ＲＥＩＳＡＬ，ｅｔａｌ．Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ：ａｒｅ－ｅｍｅｒｇｉｎｇｖｉｒａｌｄｉｓｅａｓｅｔｈｒｅａｔｅｎｉｎｇｔｈｅｇｌｏｂａｌｐｉｇｉｎｄｕｓｔｒｙ［Ｊ］．ＶｅｔＪ，２０１８，２３３：４１－４８．［２４］ＣＯＲＲＡＬ－ＬＵＧＯＡ，ＬÓＰＥＺ－ＳＩＬＥＳＭ，ＬÓＰＥＺＤ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉ⁃ｃａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ，ｌｉｎｅａｒＢ－ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓｉｎＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｖｉｒｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｆｏｒｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｂａ⁃ｓｅｌ），２０２０，８（３）：３９７．［２５］ＡＬＥＪＯＡ，ＭＡＴＡＭＯＲＯＳＴ，ＧＵＥＲＲＡＭ，ｅｔａｌ．ＡｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｔｌａｓｏｆｔｈｅＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅ［Ｊ］．ＪＶｉｒｏｌ，２０１８，９２（２３）：ｅ０１２９３．［２６］ＨＥＩＭＥＲＭＡＮＭＥ，ＭＵＲＧＩＡＭＶ，ＷＵＰ，ｅｔａｌ．ＬｉｎｅａｒｅｐｉｔｏｐｅｓｉｎＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｐ７２ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｐｒｅｐａｒｅｄａｇａｉｎｓｔｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｔｉｇｅｎ［Ｊ］．ＪＶｅｔＤｉａｇｎＩｎｖｅｓｔ，２０１８，３０（３）：４０６－４１２．［２７］ＣＨＯＩＮＲ，ＳＥＯＤＷ，ＣＨＯＩＫＭ，ｅｔａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｗｉｎｅｌｅｕｋｏ⁃ｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎｈａｐｌｏｔｙｐｅｓｉｎＹｕｃａｔａｎｍｉｎｉａｔｕｒｅｐｉｇｓｕｓｅｄａｓｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｍｏｄｅｌａｎｉｍａｌ［Ｊ］．Ａｓｉａｎ－ＡｕｓｔｒａｌａｓＪＡｎｉｍＳｃｉ，２０１６，２９（３）：３２１－３２６．［２８］ＫＲＩＮＧＥＬＵＭＪＶ，ＮＩＥＬＳＥＮＭ，ＰＡＤＫＪÆＲＳＢ，ｅｔａｌ．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＢ－ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ：ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｘｅｓ［Ｊ］．ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，２０１３，５３（１／２）：２４－３４．［２９］ＺＨＯＮＧＷ，ＲＥＣＨＥＰＡ，ＬＡＩＣＣ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅｃｈａｒａｃｔｅｒ⁃ｉｚａｔｉｏｎｏｆａｖｉｒａｌｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｅｐｉｔｏｐｅｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００３，２７８（４６）：４５１３５－４５１４４．。
抗原表位分析抗原表位（antigenic epitope），也被称为抗原决定簇，是抗原分子上可以被特异性抗体识别和结合的化学官能团。
每一个抗原可能含有多个不同的抗原表位，每个表位都可以与一个特异的抗体结合。
抗原表位有线性表位和构象表位之分，线性表位也被称为连续性表位，这种表位是由抗原蛋白线性序列上连续的氨基酸残基组成的。
构象表位也被称为非连续性表位，是由空间上紧密靠近的氨基酸形成的一个可被抗体识别的立体结构。
抗原表位的研究和识别对于疾病诊断、疫苗设计和治疗策略制定都具有至关重要的意义。
理解和分析抗原表位可以帮助我们更好地了解免疫响应的机制和如何有效地应对病原体。
蛋白抗原线性表位和构象表位。
传统的方法是将蛋白质抗原降解为小片段，然后通过测序确定抗体的结合位点。
其他技术，如ELISA法、噬菌体随机肽库、X-射线晶体学、核磁共振技术、氢氘质谱技术和生物信息学等也为表位分析提供了强大的工具。
基于质谱的蛋白测序技术是分析抗原线性表位的强有力方法，该方法还可用于通过探测具有高亲水性、表面可及性、灵活性和抗原性的区域来识别潜在的线性表位区域。
与线性表位相比，构象表位更难以绘制，氢氘交换质谱可以通过检测抗体结合对抗原蛋白氢氘交换速率的影响，从而鉴定出抗原的构象表位。
在氢氘交换过程中，与抗体结合的抗原区域会因结合的遮蔽效应而显示出较慢的交换速率，通过对比抗原单独与D2O反应和抗原与抗体结合后与D2O反应的结果，可以确定哪些肽段的交换速率受到了抗体的影响，从而确定与抗体结合的抗原构象表位。
百泰派克生物科技（BTP）拥有7大检测平台，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证。
公司基于多种成熟的技术平台，包括LC-MS、氢氘交换质谱、X-射线晶体学和生物信息学预测技术提供完善多样的抗原表位作图服务，精确鉴定线性表位和构象表位，确保提供的数据准确、可靠，为您的研发和应用提供坚实的科学支撑，欢迎您随时与我们取得联系，了解更多服务详情！抗原表位分析技术应用1.疫苗设计。
南方医科大学硕士学位论文登革病毒E蛋白的生物信息学分析，B细胞和T细胞表位的研究姓名：仲华申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：曹虹;赵卫20080601硕士学位论文登革病毒Ｅ蛋白的生物信息学分析，Ｂ细胞和Ｔ细胞表位的研究
硕士研究生：仲华指导教师：曹虹教授，赵卫副教授
摘要登革病毒（Ｄｅｎｇｕｅｖｉｒｕｓ，ＤＥＮ）为单股正链ＲＮＡ病毒，是急性蚊媒传染病一
登革热的病原体，属于黄病毒科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）黄病毒属（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）。登革病毒基因组长约ｌｌｋｂ，由单一的开放读码框架依次编码３个结构蛋白（ＰｒＭ，，Ｍ、Ｅ和Ｃ）和７个非结构蛋白。按生物学和免疫学特性分为ＤＥＮ．１、ＤＥＮ一２、ＤＥＮ．３和ＤＥＮ．４四种血清型。各血清型均可引起登革热（Ｄｅｎｇｕｅｆｅｖｅｒ，ＤＦ）和致死率很高的登革出血热（Ｄｅｎｇｕｅｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒ，ＤＨＦ）以及登革休克综合征（Ｄｅｎｇｕｅｓｈｏｃｋｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＤＳＳ）。南太平洋和东南亚地区几乎每年爆发登革热，其流行趋势也日益严峻，尤其是近期发生在巴西等地逾３万人感染的大规模流行，使得登革疫苗的研制受到人们的密切关注，但目前登革的预防主要依赖于切断蚊媒传播，尚无有效的疫苗用于其预防。登革疫苗研制的主要困难在于：一、ＤＨＦ／ＤＳＳ的发病机理（尤其是Ｂ细胞和Ｔ细胞免疫反应效应）尚未明确，多种假说如二次感染时可能存在的抗体依赖的感染增强作用（Ａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｐｅｎｄａｎｔ
ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，ＡＤＥ）假说、病毒毒力假说
和免疫病理学假说未获一致认可。ＡＤＥ效应学说认为感染ＤＥＮ后，Ｂ细胞表位可刺激Ｂ淋巴细胞产生中和抗体和增强感染并导致ＤＨＦ／ＤＳＳ的非中和抗体，而免疫病理学说认为异常的Ｔ细胞免疫反应和异常的细胞因子也参与了ＤＨＦ／ＤＳＳ的发病，即Ｔ细胞免疫诱导机体产生ＤＥＮ型特异性Ｔ细胞和血清型交叉反应性Ｔ细胞；前者保护机体免受同型病毒再次感染后者除了清除病毒也参与ＤＨＦ／ＤＳＳ发病。中文摘要诱生中和抗体和非中和抗体的Ｂ细胞表位的尚未区分以及产生保护性细胞免疫的ＤＥＮ型特异性Ｔ细胞表位的尚未鉴定严重阻碍了ＤＥＮ疫苗研发；二、没有可供使用的ＤＥＮ感染动物模型以模拟ＤＨＦ／ＤＳＳ的发病过程；三、研制的疫苗需针对四个血清型的ＤＥＮ感染有全面的保护作用，增加研制难度；四、常规疫苗因研制周期长、产量低和潜在的副作用限制其应用。新型的表位多肽疫苗是目前研发的ＤＥＮ疫苗的新方向，它是基于Ｂ细胞表位或Ｔ细胞表位合成的多肽，既能激活Ｂ细胞产生特异性抗体，保护机体免受特异病原的攻击，又能激活ＣＴＬ（细胞毒性Ｔ淋巴细胞ＣＤ８＋Ｔ细胞）清除病毒感染的靶细胞，也能激活ＣＤ４＋Ｔ细胞辅助体液免疫应答。常规疫苗如亚单位疫苗、嵌合体疫苗等多以Ｅ蛋白为其靶位，因为Ｅ蛋白是病毒体最大的结构蛋白和主要包膜糖蛋白，构成病毒粒表面的突起。它决定着病毒的组织嗜性，介导病毒与细胞受体的结合，同时它还影响病毒毒力、引起保护性免疫反应和免疫病理损伤。因此我们在本课题中以Ｅ蛋白作为研究靶位，以期通过筛选并鉴定Ｅ蛋白上潜在的型特异性保护性Ｂ细胞和Ｔ细胞抗原表位从而为表位多肽疫苗研制提供重要信息。Ｅ蛋白结构与功能的研究也一直是人们关注的焦点，近年来，通过生物信息学及序列分析软件的预测，可获得基因和蛋白质序列中蕴含的重要的信息，本文综合利用网络服务器、数据库及生物信息学软件对登革２型病毒国际标准ＮＧＣ株Ｅ蛋白的理化性质、二级结构、穿膜螺旋、结构域、空间结构、柔韧性、表面可及性、亲水性等参数进行生物信息学的分析，可全面了解Ｅ蛋白与病毒感染、毒力和免疫相关的结构特征，同时运用新型表位多肽疫苗的研究策略，预测Ｅ蛋白Ｂ细胞和Ｔ细胞抗原表位所在位置，并运用体外免疫学实验加以筛选和鉴定。
一、登革２型病毒Ｅ蛋白的生物信息学分析根据ＤＥＮ２ＮＧＣ株Ｅ蛋白氨基酸序列（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓＮｕｍｂｅｒ：
ＢＡＡ００２５５），利用在线的网络服务器ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ经Ｔａｇｌｄｅｎｔ程序分析登革病毒Ｅ蛋白分子量，等电点；经ＡＡＣｏｍｐｌｄｅｎｔ程序分析，可得到Ｅ蛋白各硕士学位论文氨基酸所占比例。运用ＤＮＡｓｔａｒ软件包中Ｐｒｏｔｅａｎ软件的Ｃｈｏｕ．Ｆａｓｍａｎ和Ｇａｍｉｅｒ－Ｒｏｂｓｏｎ方法分析Ｅ蛋白的ａ螺旋、ｐ折叠、ｐ转角和Ｃｏｉｌ卷曲所在区段。服务器ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ中分别使用ＴＭＨＭＭ软件和ｓｉｇａｌＰ２．０软件分别预测Ｅ蛋白的穿膜螺旋和信号肽切割位点，可知蛋白在第４４３＂－４６５位氨基酸和第４７２＂－＇４９４位氨基酸之间有两段穿膜结构而Ｅ蛋白并无信号肽切割位点。在免疫信息学网站ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ中分别采用Ｋａｒｐｌｕｓ＆Ｓｃｈｕｌｚ、Ｅｍｉｎｉ及Ｐａｒｋｅｒ方法分别对柔韧性、表面可及性及亲水性进行分析。通过三种方案的综合运用，发现三种参数所位于的氨基酸区段较多而且较为密集，其中表面可及性和亲水性皆可获得较高的分值。运用ｐｅｐｗｈｅｅｌ程序对Ｅ蛋白肽链作螺旋状轮图，识别疏水和亲水的区域，显示序列螺旋的横切面，反应序列的性质。Ｅ蛋白的肽轮状图可显示疏水性氨基酸；．所占比例较大，与Ｅ蛋白为包膜蛋白符合。在Ｐｒｏｓｉｔｅ数据库中分析Ｅ蛋白的结构域（Ｄｏｍａｉｎ）和空间结构可知Ｅ蛋自由３个Ｄｏｍｍｎ组成，其中ＤｏｍａｉｎＩ所在的氨基酸区段为第１＂－５２，３２～１９１
和２７８＂－－＇２９４位氨基酸。ＤｏｍａｉｎＩＩ所在的氨基酸区段为第５３，－－，１３１和１９２＂－２７７位氨基酸，而ＤｏｍｍｎＩＩＩ所在的氨基酸区段为第２９４＂－＇４９３位氨基酸。预测所得７到的激酶的磷酸化位点是信号转导的重要通路，糖基化位点可能是登革病毒包膜糖蛋白Ｅ潜在的修饰位点。Ｅ蛋白在成熟的病毒颗粒中被包装并排列成紧密的鲱鱼骨架形态，包含３０个类似救生筏状的结构，每个筏状结构由３个平行的二聚体组成。
二、登革２型病毒Ｅ蛋白的Ｂ、１ｌ细胞表位分析和多肽设计在哈佛大学网站ｈｔｔｐ：／／ｍｉｆ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ采用Ｋｏｌａｓｋａｒ＆Ｔｏｎｇａｏｎｋａｒ进行Ｂ细胞抗原表位的预测。Ｅ蛋白的Ｂ细胞抗原趋势最高分值为１．２５５，位于第４８１位氨基酸残基亮氨酸（Ｌｅｕ）上。在第２５、６０、１２０、１４０、２２０、２５０、３２０、４５０和４９０左右的氨基酸存在几个Ｂ细胞抗原趋势值较高的区域。
利用免疫信息学网站ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／提供的软件ＰｒｏＰｒｅｄ．Ｉ和
ＩＩＩ中文摘要Ｐｒ０Ｐｒｅｄ和在哈佛大学网站ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＲＡＮＫＰＥＰ／提供的软件Ｒａｎｋｐｅｐ分别进行ＨＬＡ．Ｉ和ＨＬＡ．ＩＩ类分子限制性的Ｔ细胞表位进行预测；并从中选择在我国ＨＬＡ基因分布频率最高的等位基因进行预测。综合ＰｒｏＰｒｅｄ—Ｉ、ＰｒｏＰｒｅｄ和ＲａｎｋｐｅｐＴ细胞表位预测三种软件和用于预测Ｂ细胞表位的Ｋｏｌａｓｋａｒ＆Ｔｏｎｇａｏｋａｒ方法的结果获得Ｔ细胞和Ｂ细胞候选抗原表位。综合Ｂ细胞和Ｔ细胞表位分析的结果，设计并送广州杰特伟生物有限公司合成，运用Ｆｍｏｅ－ｂｕｔｙｌ固相合成侧链保护策略，在ＡＢＩ多肽合成仪上合成抗原多肽，ＨＰＬＣ纯化和分析。得到两条登革２型病毒合成肽Ｐ１和Ｐ２，均为１５个氨基酸，具体序列为ⅪⅣＬＧＲＬＩｎ小ＰＩＶＴＥ３４５～３５９；ＥＰＧＱＬＫＬＮＷＦＫＫＧＳＳ
Ｅ３９３～３９７；纯度分别为９４．９７％；９９．１７％。同时合成一条登革ｌ型病毒的多肽作为对照（序列为ＱＨＧＴＶＬＶＱＶＫ，Ｅ３１６￣３２５），纯度为８７％。
三、登革２型病毒候选Ｂ细胞和Ｔ细胞表位多肽免疫学的研究合成肽的动物学实验：合成肽偶联载体蛋白分别与其相应组的小鼠在免疫前、第２次免疫以及末次免疫后，随机抽取的８只小鼠经间接ＥＬＩＳＡ法检测在一系列稀释度下的ＯＤ盯咖值，绘制免疫前、２次免疫后及未次免疫后的曲线变化图。合成肽的特异性实验：间接ＥＬＩＳＡ法检测将合成肽分别与已感染登革２型病毒的小鼠血清、小鼠多抗腹水及正常小鼠血清进行ＥＬＩＳＡ反应并检测其ＯＤ值，统计学处理采用ＳＰＳＳｌ３．０软件进行单因素方差分析。经单因素方差分析（Ｏｎｅ．ｗａｙＡＮＯＶＡ），合成肽Ｐｌ、Ｐ２分别与已感染登革２型病毒的小鼠血清、小鼠多抗腹水及正常小鼠血清进行ＥＬＩＳＡ反应的ＯＤ值之间的差异有统计学意义（Ｆ＝５０．８０７，Ｐ＝０．０００；Ｆ＝２３２．０５０，Ｐ＝０．ｏｏｏ）。合成肽的血清学实验：间接ＥＬＩＳＡ法检测合成肽与１０份Ｊ下常人血清及登革病毒感染恢复期患者血清的反应，统计学处理采用ＳＰＳＳｌ３．０软件进行两样本ｆ检验。经两样本ｔ检验，合成肽Ｐ１、Ｐ２分别与恢复期患者血清及正常人血清的
ＩＶ硕士学位论文ＥＬＩＳＡ结果比较，差异有统计学意义（产８．３７４，Ｐ＝０。０００；ｔ＝６．５０４，Ｐ＝０．０００）。合成肽的ＥＬＩＳＰＯＴ实验：建立登革病毒感染小鼠模型后，分离小鼠脾脏淋巴细胞，采用酶联免疫斑点（ＥＬＩＳＰＯＴ）实验用ＩＦＮ吖ＥＬＩＳＰＯＴ试剂盒检测抗原表位多肽能否刺激机体产生细胞免疫，刺激Ｔ淋巴细胞分泌细胞因子如ＩＦＮ－１，，记数斑点形成细胞即ＩＦＮ．丫分泌细胞数量，统计学处理采用ＳＰＳＳｌ３．０软件进行析因设计的方差分析，确定抗原多肽是否为ＤＥＮ型特异性Ｔ细胞表位。ＩＦＮ吖ＥＬＩＳＰＯＴ试剂盒检测ＩＦＮ吖生成细胞，接种病毒组比正常组产生较多ＩＦＮ吖生成细胞，正常组产生细胞为０／１ｘ１０５个细胞，且接种病毒组中合成肽刺激组ＩＦＮ吖生成细胞数目为１５￣４５／ｌ×１０５个细胞和１１３～１８０／４ｘ１０５个细胞，与无肽刺激组（空白对照）、无关多肽刺激组（阴性对照）和ＰＨＡ刺激组（阳性对照）相比，差异有统计学意义。因无肽刺激组（空白对照）和无关多肽刺激组（阴性对照）的斑点数量均为０，故比较在两种细胞浓度下，另外两种不同处理ＰＨＡ刺激组（阳性对照）和实验组（合成肽Ｐｌ刺激组）的ＥＬＩＳＰＯＴ数目的差异。析因分析结果表明，两种不同处理的主效应即合成肽Ｐｌ刺激组与ＰＨＡ刺激组间差异有统计学意义（Ｆ＝９８４８．８１８，Ｐ＝０．０００）；两种细胞浓度的主效应有统计学意义（庐１３６７．７１７，Ｐ＝－０．０００）；不同处理组问和细胞浓度的交互效应有统计学意义（Ｆ＝１７．０８１，Ｐ＝０．０００）。以上结果表明，我们的筛选设计并合成的合成肽ＰＩＥ３４５～３５９在表位预测软件中Ｂ细胞表位和Ｔ细胞表位预测均获得较高分值，经生物信息学分析其可能同时包含Ｂ细胞和Ｔ细胞表位，同时合成肽Ｐ２Ｅ３ｓ３￣３孵也在Ｂ细胞表位预测软件中预测为潜在的Ｂ细胞表位，而在体外免疫学实验研究中，应用ＥＬＩＳＡ方法检测的动物学实验、特异性实验和血清学结合实验中两合成肽Ｐ１、Ｐ２均比对照组具有良好的免疫原性、特异性和结合性，在ＥＬＩＳＰＯＴ实验中，，合成肽Ｐ１也能良好地诱发Ｔｈｌ型细胞免疫并刺激已感染ＤＥＮ并获得免疫记忆的小鼠脾脏Ｔ淋巴细胞分泌较高水平的ＩＦＮ吖，与阴性对照、空白对照和阳性对照的差别有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０１）。
