LC_MS_MS测定鱼肉中的孔雀石绿及其代谢物残留及基质效应分析_郝家勇

0 引言
孔 雀 石 绿 （ MG） 又 名 碱 性 孔 雀 绿 ， 苯 胺 绿 等 ， 为金属光泽深绿色晶状固体， 属于三苯甲烷染料， 极易溶于水和乙醇[1]， 最早用于纺织工艺， 后来孔雀 石绿开始作为驱虫剂、 杀菌剂和防腐剂出现在水产
养殖方面。 孔雀石绿因为高效、 价廉等优点广泛应 用于预防和治疗鱼类的水霉病和对原虫的控制[2]。 孔 雀石绿还被当作消毒剂用于鱼类贩运过程中延长鱼 类的存活时间。 研究结果表明， 孔雀石绿 （ MG） 及 其代谢产物隐色孔雀石绿 （ LMG） 具有潜在的致癌、 致畸、 致突变的毒副作用[3]。 许多国家已经将其列为
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食 用 鱼 类 养 殖 禁 用 药 物[4]， 我 国 于 2002 年 将 其 列 入 禁 用 名 单 。 但 是 由 于 MG 具 有 抗 菌 效 果 好 、 价 格 低 廉 的 特 点 ， 在 水 产 品 养 殖 中 仍 有 违 规 使 用 的 情 况[5]。 目 前 有 关 MG 和 LMG 的 检 测 方 法 主 要 有 ： 气 相 色 谱—质谱法[6]、 高效液相色谱法[7-9]、 液相色谱 —串接 质 谱 法[10-11]。 液 相 色 谱 串 接 质 谱 法 具 有 灵 敏 、 准 确 、 检出限低等优点， 近年来被广泛使用。 但是液相色 谱法串接质谱法普遍存在基质效应[12]， 在 LC- MS/MS 检测过程中的基质效应是由于分析物的共流出组分影 响待测组分离子化效率所导致， 主要受内源性组分的 影响。 国内对孔雀石绿及其代谢物测定方法的研究主 要讨论色谱或质谱条件的影响， 未见对基质效应的研 究报道。 本文在讨论质谱条件的基础上， 采用 B K Matuszewski 等 人[13]提 出 的 提 取 后 添 加 法 建 立 数 学 模 型评价了基质效应， 并进一步讨论基质效应对液 相—串接质谱法鱼肉中的 LMG 和 MG 的影响。
1.4 色谱与质谱条件 1.4.1 色谱条件
色谱柱： Extend- C18， 1.8 μm， 3.0 mm×10 mm； 柱 温 ： 40 ℃； 流 动 相 ： A 0.1%甲 酸 水 溶 液 （ pH 值 4.5） ， B 乙腈； 进样量： 2 μL； 流量： 0.3 mL/min。
梯度洗脱条件见表 1。
时间 t/min 0.0 2.0 10.0
表 1 梯度洗脱条件
乙腈体积分数 /% 28 98 98
醋酸铵体积分数 /% 72 2 2
1.4.2 质谱条件 采用电喷雾离子源， 通过正离子多反应监测扫
描 （ MRM） 模 式 ， 对 GM， LMG 分 别 进 行 监 测 。 离 子 源 ： ESI （ +） ； 毛 细 管 电 压 ： 3 500 V； 雾 化 器 压 力 ： 35 psi； 干 燥 气 流 量 ： 11 L/min； 干 燥 气 温 度 ： 350 ℃； 锥孔电压： 15 V。
extend C18 色谱柱分离后进质谱测定， 采用电喷雾离子源。 结果表明， 对于 LMG， MG 质量浓度在 0.1~200 μg/L 内均呈
线性关系， MG 和 LMG 的检出限分别为 0.01 μg/mL 和 0.001 μg/mL。 以鲤鱼为基质， 采用提取后添加方式配制了与纯
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标准样品浓度相同的标准曲线， 研究了基质效应对 LMG， MG 的影响， 样品基质对 LMG， MG 响 应 表 现 为 抑 制 作 用 ，
待测物优化质谱条件见表 2。
化合物 MG LMG
表 2 待测物优化质谱条件
母离子 /m·z- 1 329.3 329.3 331.3 331.3
子离子 /m·z- 1 313.3 208.2 316.3 239.2
郝家勇， 王 远， 鲁立良
（ 新疆农垦科学院 农业部食品质量监督检验测试中心， 新疆 石河子 832000）
摘要： 应用高效液相色 谱—串 接 质 谱 联 用 技 术 测 定 了 鱼 肉 中 的 孔 雀 石 绿 （ MG） 及 其 代谢物隐色孔雀石绿 （ LMG） 的
残留， 样品经过缓冲溶液提取后， 经二氯甲烷反萃取后浓缩， 残渣用乙腈 +0.1%甲酸水溶液 （ 1+1） 溶解， 通过 Aglient
孔雀石绿、 隐色孔雀石绿， Sigma- Aldrich 生产； 乙腈， 德国 CNW 生产； 甲酸， 德国 Merck 生产； 乙 酸铵， 优级纯。 1.2 标准溶液配制
储备液： 配制质量浓度为 1.00 mg/mL 的 孔 雀 石 绿和隐性孔雀石绿乙腈储备液， 并与 - 18 ℃避光 保 存 。 标 准 曲 线 ： 采 用 乙 腈 +0.1%甲 酸 水 溶 液 （ 1+1） 稀 释 储 备 液 为 系 列 标 准 液 ， 质 量 浓 度 分 别 为 0.05， 0.1， 0.2， 0.25， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0， 10.0， 20.0， 50.0， 100.0， 200.0 μg/mL。 1.3 样品制备
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪 （ Agilent1200） —串接四极杆质
谱仪 （ Agilent 6460） ， Agilent 公 司 提 供 ； RE—52AA 型旋转蒸发器， 上海雅荣生化仪器设备有限公司提 供 ； SK—1 型 快 速 混 匀 器 ， 江 苏 正 基 仪 器 有 限 公 司 提供； XiangYi H—1650 型离心机， 长沙湘仪离心机 仪器有限公司提供。
在 5.00 g 鱼 肉 组 织 中 加 入 1.00 mL 质 量 浓 度 0.25 g/mL 盐酸羟胺溶液、 2.00 mL 体积分数 0.1 mL/L 对甲苯磺酸溶液， 2.00 mL 浓度 0.1 mol/L 乙酸氨缓冲 溶液 （ pH 值 4.5） 和 20.00 mL 乙腈。 快速混匀 2 min 后， 离心 10 000 r/min， 倒出上 清 液 ， 于 沉 淀 物 中 加 入 20.00 mL 乙腈， 混匀， 离心。 合并上清液。 向合 并后的乙腈提取液中加入 35.00 mL 水和 30.00 mL 二 氯甲烷， 振摇， 收集二氯甲烷层， 再用 20.00 mL 二 氯甲烷重复提取 1 次， 合并二氯甲烷提取液， 减压 蒸 干 ， 残 渣 用 2 mL 乙 腈 +0.1%甲 酸 水 溶 液 （ 1+1） 定容后上机待用。
收稿日期： 2011- 11- 18 作者简介： 郝家勇 （ 1977— ） ， 男， 江苏人， 硕士， 高级实验师， 研究方向： 食品安全。 E- mail: haojiayong2002@,163.com。
2012 年第 4 期
郝家勇， 等： LC-MS/MS 测定鱼肉中的孔雀石绿及其代谢物残留及基质效应分析
（ RE） 和方法前处理效率 （ PE） 。
关键词： 高效液相色谱—串接质谱联用； 孔雀石绿； 鱼肉； 基质效应； 残留量
中图分类号： S948
文献标志码： A
doi： 10.3969/jissn.1671- 9646（ X） .2012.04.039
LC- MS/MS Detecting the Residues of Malachite Green and Leuco Metabolites in Fish and the Affect of Matrix
HAO Jia- yong， WANG Yuan， LU Li- liang （ Xinjiang Academy of Agricultural Reclamation Science， Food Quality Supervision and Testing Center，
Ministry of Agriculture， Shihezi， Xinjiang 832000， China） Abstract： The residues of malachite green (MG) and its leuco metabolites (LMG) in fish are detected by LC- MS/MS. The samples are extracted with buffer solution， stripped by dichloromethane and then concentrated; the residues are dissolved by acetonitrile+0.1% formic acid (1+1). Chromatographic separation is achieved by using Aglient extend C18 column. Identification and quantification are performed using multiple reaction monitoring (MRM) with electrospray ion source and positive ion multiple reaction monitoring mode detection. The results show that the linear ranges of MG and LMG between 0.1~200 μg/L, and the detection limits of LMG and MG are 0.01， 0.001 μg/mL， respectively. Using carp matrix of biological samples in this paper， the concentration of configuration standard curve by spiked after extraction method is same to configuration standard curve of pure standard samples. The matrix effects to LMG， MG are studied， and the matrix effects suppress response of LMG， MG， and the inhibition decreases with increasing of concentration of LMG and MG. In the case of the same matrix effects， MG is more susceptible to matrix effects. On 1.0， 50.0 μg/mL level of standard addition， using the methods of spiked before extraction and spiked after extraction， recovery of extraction procedure (RE%) and process efficiency (PE%) are calculated. Key words： LC-MS/MS； malachite green； fish； the matrix effects； residues
并 且 抑 制 作 用 随 浓 度 的 增 加 而 减 弱 。 在 基 质 效 应 相 同 的 情 况 下 ， MG 更 容 易 受 基 质 的 影 响 。 在 质 量 浓 度 1.0，
50.0 μg/mL 的 标 准 加 入 水 平 下 ， 采 用 样 品 基 质 提 取 前 添 加 和 样 品 基 质 提 取 后 添 加 的 方 式 ， 计 算 了 样 品 提 取 回 收 率
第 4 期 （ 总第 277 期）
农产品加工·学刊
No.4
2012 年 4 月
Academic Periodical of Farm Products Processing
Apr.
文章编号： 1671- 9646 （ 2012） 04- 0132- 04
LC- MS/MS 测定鱼肉中的孔雀石绿及其 代谢物残留及基质效应分析