蛋白定量分析实验
实验一双缩脲法测定蛋白质含量
一．实验目的
掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和标准曲线的绘制。
二．实验原理
在碱性溶液中，具有两个或两个以上肽键的化合物（如蛋白质）可与Cu2+结合生成紫色化合物（双缩脲反应），颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的浓度。在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于520nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。
三．实验仪器及试剂
容量瓶、试管、试管架、恒温水浴槽、吸量管、分光光度计、比色皿
试剂：①标准酪蛋白溶液10mg/ml
②双缩脲试剂: 溶解2.5g CuSO4·5H2O于100ml水中，加热溶解，取酒
石酸钠10g、碘化钾5g，溶于500ml水中，再加5mol/L NaOH溶液300ml
混合，倒入硫酸铜溶液，加水至1000ml
③小鼠肝脏蛋白原浆
四．实验内容
（1）取小试管7支，编号，按下表注入溶液
（2）混匀后，于37℃水浴中保温15min，在520nm波长下比色，以第6管调零点，测得各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质的克数为横坐标，绘成曲线。
（3）按表中第七管的数据加入溶液，在37℃水浴中放置15min，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线即得出每100ml小鼠肝脏蛋白原浆溶液中蛋白质的克数。
五.实验数据记录及结果分析
绘制曲线如下：
由图可知，当吸光度为0.107时，相对应的蛋白质克数为1.38 mg，则100ml 小鼠肝脏蛋白原浆液中蛋白质克数为1.38 g。
实验二考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
一．实验目的
掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法；熟悉紫外分光光
度计的使用。
二．实验原理
考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，在一定蛋白质浓度范围内，结合物在595 nm波长下有最大吸收峰，测其光的吸收量即可得结合蛋白质的量。
三．实验仪器及试剂
仪器：分光光度计，试管，吸量管，比色皿
试剂：①考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 ml。
②标准蛋白溶液500µg/ml
③50倍稀释后的小鼠肝脏蛋白原浆
四．实验内容
（1）取试管三支，按下表操作：
五．实验数据记录及结果分析
测得标准管与样品管的吸光度分别为0.418，0.222
则样品中蛋白质的含量µg/ml=(0.222/0.418)×500=265.6µg/ml
则稀释前小鼠肝脏蛋白原浆中蛋白质的含量为13.3mg/ml。
实验三紫外分光光度法测定蛋白质含量
一．实验目的
掌握紫外吸收法定量测定蛋白质含量的原理和方法；熟悉紫外分光光度计的使用。
二．实验原理
蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸，使蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
三．实验仪器与试剂
试剂：①标准蛋白质溶液1mg/ml
②30倍稀释后的小鼠肝脏蛋白原浆
仪器：紫外分光光度计，吸量管，试管，比色皿
四．实验内容
280nm的光吸收法
下测定各管吸光度，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线五．实验数据记录及结果分析
绘制曲线如下：
由图可知，当吸光度为0.236时，相对应的蛋白质浓度为0.243 mg/ml，则稀释前小鼠肝脏蛋白原浆液中蛋白质浓度为48.6mg/ml
