疟原虫镜检技术

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血片制作（取血方法）
• 采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴 儿可从拇趾或足跟取血。先用75%酒精棉球消毒取血部 位，待酒精干后，用左手拇指和食指轻轻捻转耳垂边 缘或夹住被检者手指尖稍下方，右手持消毒针，迅速 刺入取血部位1-2mm，不宜过深或过浅。然后用左手大 拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。
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血片制作与染色的注意事项
• • • • 载玻片使用前一定要清洁，否则会影响血片制作和镜检结果。 厚血膜干燥时不要加热，否则会使疟原虫变形，影响镜检结果。 配制母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量。 固定薄血膜时，不要将甲醇接触到厚血膜，否则染色时厚血膜 将不能溶血。 • 冲洗染液时，水流要轻缓，不要冲掉厚血膜。
镜检疟原虫技术
2012.3
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主要内容
• 血片制作与染色 • 疟原虫形态与鉴别 • 疟原虫镜检
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血片制作与染色
• 血片制作 • 血片染色
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血片制作（所需用具）
• • • • • 载玻片 75%的酒精棉球 采血针 记号笔 玻片盒
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血片制作（血膜的制作）
• 用于检查疟原虫的血涂片有两种： 一种是将血液涂成薄膜状，称薄血膜； 一种是将血液涂成圆盘形，称厚血膜。 • 薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。
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血片制作和染色（质量判定标准）
好：厚薄血膜均好，或薄血膜好，厚血 膜中。 中：薄血膜中，厚血膜好或中。 差：薄血膜差，或厚薄血膜均差。
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血片制作和染色(质量规范)
好 厚 血 膜 血 片 制 作 质 量 血量 位置 直径 外观 4.0-5.0mm3 玻片右1/3 0.8-1.0cm 圆形，厚膜均匀，边缘 整齐 中 略多或略少 稍偏右 0.7-0.8或1.0-1.2cm 圆形，稍不均，不整齐 差 过多或过少 偏右过多 <0.7或>1.2cm 厚薄不均匀影响着 色

血疟原虫检查操作规程(sop)
1. 目的:通过查找血液涂片中疟原虫，为临床疟疾的感染提供辅助诊断。

2．实验原理:应用瑞氏染色原理对制备好的厚血片和薄血片进行染色后在显微镜下查找疟原虫。

3.标本采集
3.1标本采集前病人的准备：间日疟及三日疟患者应在发作后数小时至10余小时采血；恶性疟患者，应在发作后20小时左右采血。

3.2标本种类：全血或末梢血。

3.3标本要求：厚血片溶血要及时。

1．标本运送：室温运送。

2．标本拒收标准：被细菌污染。

3．操作步骤
6.1 薄血片法：
6.1.1在洁净玻片上，滴血液标本1滴，以常法推制成薄片。

6.1.2 血膜完全干燥后即可用瑞氏法染色，干后用油镜镜检。

6.2厚血片法：
6.2.1在洁净玻片上，滴血液标本2滴。

6.2.2用推片将血液由内向外转涂成直径约1cm、厚薄均匀的血膜，在室温中自然干燥。

6.2.3 在干燥的血膜上滴加蒸馏水数滴，完全覆盖血膜，溶血约5分钟后倾去溶血液。

6.2.4 不必待干，进行瑞氏染色，干后镜检。

4．结果判断
在油镜下观察，薄片须至少100个视野，厚血片至少20个视野，才能报告“未见疟原虫”；发现虫体后还应在薄血片上进行分类鉴别。

8．注意事项
8.1 染色后，水洗时不要先倒去染液，应让清水流进染液，使沉渣冲走。

8.2 注意区别易与疟原虫混淆的其他杂物。

粪便水洗沉淀法
肝吸虫卵
大小：最小虫卵（30×20μm） 形状：芝麻、西瓜子 颜色：淡褐色
卵壳厚薄：较厚，疣状突起
卵盖：肩峰突起 卵内含物：梨形毛蚴
肺吸虫卵
大小：比受精蛔虫卵大 形状：椭圆、多态 颜色：金黄色 卵壳厚薄：厚薄不均 卵盖:大、倾斜 卵内含物：卵细胞、 卵黄细胞
文本内容
姜片虫卵
大小：最大的虫卵 形状：长椭圆形 颜色：淡黄色 卵壳厚薄：薄、均匀 卵盖：较小 内含物：卵细胞、 卵黄细胞
疟原虫显微镜检查
张永海 2014.6
病原学检查---厚薄血膜法

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血涂片制作及染色 1．材料 ：载玻片，消毒棉球，酒精，剪刀，蜡笔，吸 管，蒸馏水，培养皿，姬氏或瑞氏染液，缓冲液等。 方法：薄血膜加厚血膜 厚血膜涂片： 优点：检出率高，用于定性。 缺点：不易鉴别虫种 薄血膜涂片： 优点：容易辨认虫种 缺点：易漏检。
虫卵显微镜检查
粪便检查法
生理盐水涂片法
基本原理：生理盐水作为粪便的稀释剂 ，使病原 体在等渗环境下保持原有形态和活力以利于观察。 适用：产卵量较多或较大的寄生虫。
实验材料：载玻片、盖玻片、竹签、滴管、大便 杯生理盐水、显微镜。
生理盐水涂片法--步骤
1）滴一滴生理盐水在载玻片中央。
2）用竹签取米粒大小的粪便，在生理盐水中混 匀，其厚度能透过粪膜隐约辨认玻片下的字迹为 宜，注意去除粪便渣滓。一般在低倍镜下检查， 镜检顺序，由上至下，由左至右，不要遗漏。如 发现可疑物再转高倍镜观察，加盖玻片 。
棉拭子法
试剂：生理盐水、饱和盐水 （2）仪器：棉棒、载玻片、试管、青霉素小瓶 （3）操作步骤 ①将棉签浸入试管中的生理盐水中，取出时拧去过 多的水滴。 ②清晨排便之前在肛门周围擦拭。

疟疾的检查与诊断病原学检查确诊疟疾最可靠的依据是从受检者的外周血中检出疟原虫。

厚、薄血膜染色镜检是目前最常用的方法。

在高度怀疑疟疾时，如果血液涂片为阴性，应当重复涂片镜检。

血液涂片的染色常使用Giemsa染液、Field染液或其他Romanowsky染色劑。

镜检疟原虫时应当同时对厚血涂片和薄血涂片进行检查。

薄血涂片应迅速风干，用无水甲醇固定后染色，然后在油镜（放大1000倍）下检查膜尾红细胞，以每1000个红细胞的寄生红细胞个数表示。

厚血涂片很可能会不均匀，涂片时应充分干燥和染色，不得固定。

计数寄生虫和白细胞（至少200个），并根据总白细胞数目计算单位体积内的寄生虫数目。

在判断厚血涂片为阴性前，应在油镜下检查100～200个区域。

薄血涂片和厚血涂片有着各自的优点和缺点。

薄血涂片中疟原虫的形态完整而典型，容易识别和鉴别虫种，但疟原虫密度低时，容易漏检;厚血涂片制作过程中多层的红细胞相互重叠并且被溶解，因此可以使疟原虫集中（比薄血涂片集中40～100倍），提高检出灵敏度，但由于染色过程中红细胞溶解，疟原虫形态有所改变，虫种鉴别困难。

因此，最好在一张玻片上同时制作两种血涂片，如果在厚血涂片查到疟原虫而鉴别虫种困难时，可再检查薄血涂片。

恶性疟在发作开始时，间日疟在发作后数小时至10余小时采血能够提高检出率。

免疫学检查目前已经广泛使用的恶性疟原虫抗体诊断棒或诊断卡能够快速、简单、敏感和特异地对恶性疟原虫特异性、富含组氨酸的蛋白2（NHRP2）、乳酸脱氢酶或醛缩酶抗原进行检测，并借此将恶性疟和其他危险性较低的疟疾区分开来。

此外，常用的方法还有间接荧光抗体试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验等。

由于抗体在患者治愈后仍能存在一段时间，且广泛存在个体差异，因此检测抗体主要用于疟疾的流行病学调查、防治效果评估及输血对象的筛选，在临床上仅作辅助诊断。

分子生物学技术聚合酶链式反应（PCR）和核酸探针已用于疟疾诊断。

分子生物学检测技术的最突出优点是对低疟原虫血症的检出率较高。