小动物活体成像常见问题及分析

小动物活体成像常见问题及分析1.荧光素酶的发光是否需要激发光？底物荧光素(Luciferin) 是如何进入小鼠体内的？需要多少？荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素(D-Luciferin)。

荧光素酶有554个氨基酸，约50KD。

荧光素酶的底物荧光素，约280道尔顿。

荧光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。

荧光素是腹腔注射或尾部静脉注射进入小鼠体内的，约一分钟就可以扩散到小鼠全身。

大部分发表的文章中，荧光素的浓度是150mg/kg。

20克的小鼠需要3毫克的荧光素。

常用方法是腹腔注射，这种方法扩散较慢、开始发光慢、持续发光长。

若进行荧光素静脉注射，这种方法扩散快、开始发光快，但发光持续时间很短。

2.有几种常用的荧光素酶？特性如何？常用的有两种荧光素酶，Luciferase 和Renilla 荧光素酶，二者的底物不一样，前者的底物是D-luciferin，后者的底物是coelentarizine 。

二者的发光颜色不一样，前者所发的光波长在540-600nm，后者所发的光波长在460-540nm 左右。

前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快。

大部分的发表文章通常使用前者用作报告基因，也有一些文章使用两者进行双标记。

3.能标记病毒吗？能标记病毒的某一个基因吗？可以标记病毒，由于病毒在核酸结构上的特性，每个病毒标记的方法不一样，具体的可以参见有关文献。

还没有看到标记病毒某一个基因的报道，但理论上讲，将荧光素酶基因与想标记的基因平行表达，可以标记任何基因。

交通大学的专家已经标记了腺病毒、腺相关病毒进行了基因治疗方面的活体成像实验。

4.细菌标记问题对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子luxABCDE 控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。

利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。

但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。

5.荧光素酶的发光特性如何？荧光素腹腔注射老鼠后约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光，十分钟后强度达到稳定的最高点。

在最高点持续约20-30 分钟后开始衰减，约三小时后荧光素排除，发光全部消失。

最好的检测时间是在注射后15 到35 分钟之间。

6.对于转基因小鼠来说，荧光素酶与标记基因的平行表达情况如何？对我们已经标记好的商品化出售的转基因小鼠来说，每一种小鼠都按照我们预先设定的标准进行严格的表达筛选，而且这种筛选是在不同代之间连续进行，以保证该基因在表达和遗传上的稳定性。

7.标记好的细胞的荧光素酶是随机还是插入固定的位点？插入的位点是随机的，但每一个构建好的细胞株我们都做过详细的分析，与其母细胞株进行详细的比较，证明荧光素酶的插入对细胞的各种特性(包括生长周期, 成瘤性等)没有造成影响。

8.如何保证荧光素酶(Luciferase) 的稳定性？两次观察间隔时间最短为多长时间？荧光素酶基因是插到细胞染色体内的，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光酶也会得到持续稳定的表达。

荧光素酶的半衰期约三个小时, 所以只有活细胞才能够持续表达荧光素酶。

观察时间的间隔没有最短限制，只要观察的条件控制一致就可以。

虽然底物在动物体内有一定的代谢过程，但是上一次底物的残留曲线可以知道，可以控制对下一次观察结果的影响。

9.标记的肿瘤接种以后，会发生luciferase 的丢失吗？可以用肿瘤块而不是细胞接种吗？没有正式的报道丢失Luciferase 的情况。

丢失的可能性及量非常小，不会影响实验结果。

一些实验报道的结果中，标记的细胞在动物体内存活几年的时间还可以持续发光，说明Luciferase 基因的标记非常稳定。

可以先用标记的细胞在皮下接种，然后从皮下取出肿瘤块进行原位接种。

10.在在in vitro 的细胞培养中，为什么要经常用抗生素筛选？荧光素酶基因标记的细胞株是经过单克隆筛选培养过的稳定的细胞株。

体外培养过程中，不筛选也可以，只要时间不是很长，接种代数不要很多。

到目前为止，还没有发现基因丢失的情况。

但若接种的代数过多，建议用药物筛选一段时间或从原始的细胞株培养以保证细胞发光的强度。

11.荧光素酶基因在标记的细胞中有多少个COPY ，在什么位点？最开始专家曾研究过细胞中的copy 数目和标记的位点。

但发现对于实验没有任何影响，后来的实验中基本不进行那样的研究。

12.标记细胞与标记基因所用的启动子有何不同？标记细胞一般用在细胞内能稳定表达的启动子，显示细胞的数目。

标记基因一般用此基因的启动子，与此基因平行表达，显示此基因的表达数目。

13.荧光素酶的表达高低与所用启动子的活性有关吗？有关，启动子的活性高，则荧光素酶的表达高，启动子的活性低，则荧光素酶的表达低。

还可以根据此原理，用特定的启动子驱动荧光素酶，来观察该启动子在活体动物体内的特定条件下的表达情况，并检测影响该启动子表达的因素。

这正体现了应用活体成像技术研究的优势。

14.组织切片可以观察到生物发光吗？可以，但荧光酶的体外活性保持时间比较短，约几十分钟。

有相关的文献。

15.正常成体小鼠可以看到体内发光吗？是否不需要裸鼠？可以。

成体老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的区别只在与对可见光的穿透性不同，可以看到成体正常老鼠的体内发光。

这正是这项技术的价值所在。

可见光的穿透能力在3-4cm，所以大鼠也可以作为活体成像的动物，并有很多关于大鼠的文章。

16.能检测在组织内部的发光吗？光能透过肌肤多深？可以。

若有发光足够强的标记细胞，在老鼠体内任何一个地方都能看到约一立方毫米的细胞瘤(约10 6 细胞)，穿透性可达到3-4cm。

越是表浅的细胞，越容易观察到。

17.仪器灵敏度如何？实践证明，该系统具有最优秀的灵敏度：小鼠皮下总计1000 个细胞或每mm² 20 个细胞可以很容易地被检测到，探测极限是一丛150 – 250 个细胞，在微孔细胞板中少到10 个细胞可以检测到。

该系统具有无与伦比的灵敏度，主要是由于背照射背部薄化冷CCD 以及密闭性非常好的暗箱。

18.活体动物光学成像技术如何定量分析？活体动物光学成像技术采取绝对光子数的计算方法，记录单位时间内、单位面积接受到的光子数。

这样，不同时间、不同仪器的测量结果可以进行比较，具有绝对的定量意义。

每一个新标记的细胞株都要进行全面的定量分析才能用于定量实验，其中包括在体外和体内固定位置细胞发光的标准曲线。

19.不同的组织对光的吸收程度不一样，不同的组织之间能进行定量研究吗？不能。

目前的文献都是同样的组织比较，进行同样组织的前后不同时间的定量分析。

20.荧光素酶的发光强度是否同细胞的数量成正比？是的，荧光素酶的发光强度同标记的靶点, 包括细胞、基因、细菌和病毒的数量成正比。

密西根大学Brian Ross 发表的一篇文章专门研究了这个问题。

确定荧光素酶的发光强度与细胞数成正比关系，并且线性关系到0.9 以上。

21.仪器的解析度如何？分辨率如何？仪器的最高解析度在几毫米左右。

由于可见光是漫射光，在体内走的路线不是直线，所以该仪器的体内光源的分辨率不是很好，通过该仪器观察的发光图片不能代表发光物质的结构信息，在动物体表所捕捉的发光信号只能代表发光的强度和大概的位置。

小动物CT 和MRI，在这方面具有优势，因为放射线走的路线很直。

22.能定位在哪个脏器吗？凭什么？当进行肿瘤转移研究的实验时，在观察期间，不杀死动物，如何判断某一部位发光是由于皮肤、皮下组织，肌肉，脏器还是骨骼的肿瘤转移造成的发光？特别是对于一些较小的脏器，如淋巴结转移。

此技术无法直接定位标记细胞和基因所在的组织和器官。

但是实验人员凭经验，可以靠发光细胞在老鼠的身体位置推断标记细胞或基因所在的脏器。

若需要证实, 还需要将老鼠解剖，进行体外检测。

23.活体动物可见光成像系统还有哪些附件？该系统还提供观察荧光功能的附件和小动物麻醉系统。

荧光发光附件包括一个激发光源，三种不同的激发装置（分别适用于不同的光源），一套滤光片（四套或六套）；也可以选配荧光透射仪（用于透射荧光成像）；直角3D 成像装置（了解图像的三维信息）；还有MACU，用于与小动物PET 兼容等。

荧光成像的配件可用于研究包括绿色荧光蛋白、RFP、Cy5、Cy7 及其它荧光报告机团标记的物质在体内和体外的检测。

24.为什么建议选择气体麻醉机？一般建议在活体生物发光成像检测中使用气体麻醉技术，原因有两个方面。

第一，由于活体动物发出的生物发光信号非常微弱，需要较长的检测时间，为了更好的控制动物在检测过程中的麻醉深度，使生物发光的检测顺利进行，避免动物因麻醉不足而在检测过程中苏醒或者因麻醉过量而在检测过程中死亡。

第二，由于活体光学成像需要应用大量的裸鼠进行实验，而裸鼠在麻醉后体温下降明显，麻醉时间过长会影响裸鼠的正常生理活动，为了检测后动物能更快的苏醒，不会导致动物由于腹腔麻醉而造成的体温下降时间过长。

25.为什么不建议用乙醚作为麻醉剂？乙醚在我国的动物实验过程中经常用来麻醉动物，有些科研人员把乙谜倒在棉球上，把动物和棉球放到密闭的罐内麻醉动物。

这种办法无法控制动物的麻醉深度，往往造成动物的死亡。

另外，实验人员大量地吸入乙醚，乙醚会在人体的脂肪组织中蓄积，对人的健康不利。

乙醚有强大的挥发性、易燃性、易爆炸性，决不能替代Isoflurane或其它麻醉剂用麻醉机麻醉动物。

有燃烧和爆炸的危险。

26.关于动物麻醉用麻醉剂异氟烷的特性Isoflurane 是一种无色、不易燃、无爆炸性的，有刺激性的、强挥发性的液体。

可在常温下保存。

不能太阳光直射或受热。

在美国Isoflurane 不象其它麻醉药品需要严格的消耗或使用记录。

在动物吸入麻醉中最为普遍。

在我国有Isoflurane 的生产，称为异氟烷。

27.荧光素酶发光的波长与体内的穿透性如何关系？荧光素酶发出的光主要是偏红光，与绿色荧光蛋白(GFP)的绿色荧光不同。

荧光素酶的偏红光比绿色荧光蛋白的绿光在体内的穿透性要强近一百倍。

因为光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。

血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。

但是在可见光大于600 纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。

因此，在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。

28.为什么建议尽量用RFP 而不是GFP 来检测体内发光?红光比绿光在体内的穿透性要强近一百倍。

波长越长的荧光越容易透过组织，在条件允许的情况下，我们建议选择波长较长的荧光染料。

29.荧光检测与生物发光检测的优势与劣势比较如何？荧光发光需要激发光，但生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度。