超高效液相色谱_串联质谱法测定猪尿中9种_受体激动剂残留

超高效液相色谱－串联质谱法测定猪尿中9种β－受体激动剂残留

孙涛1刘圣红1乔昆云1廖春蓉2(1.新疆农业科学院中心实验室，乌鲁木齐，830091;2.乌鲁木齐高新区疾病预防控制中心，乌鲁木齐，830011)

摘要采用超高效液相色谱－串联质谱(UPLC－MS/MS)技术，检测了猪尿中9种β－受体激动剂的残留。样品加入乙酸铵溶液后经β－盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，用氢氧化钠溶液调pH，分别用乙酸乙酯和甲基叔丁基醚萃取、浓缩后过MCX柱净化，以甲醇0．1%甲酸溶液(10+90)定容，经WatersC18超高压液相色谱柱分离，电喷雾(ESI)串联四极杆质谱检测，采用多反应监测(MRM)分析，对液质分离条件和样品前处理条件进行了优化。结果表明，9种β－受体激动剂在1．0～100ng/mL范围内线性良好相关系数r均大于0．9990，定量限范围为0．037～0．14μg/L。该方法简便、快速、灵敏，测定结果能满足猪尿中β－受体激动剂的多残留检测要求。关键词超高效液相色谱－串联质谱猪尿β－受体激动剂多残留

作者简介:孙涛，男，1978年出生，实验师，主要从事农产品质量安全监测分析工作。E-mail:suntaotxy@126．comβ－受体激动剂(β－agonists)是一类化学合成的苯乙醇胺类衍生物，可分为含取代基的苯胺型(如克仑特罗)、苯酚型(如沙丁胺醇)、苯二酚型(如特布他林)三大类。欧盟、美国等都先后立法禁止在畜禽生产上使用该类药物，我国政府也早在2002年就明令禁止使用［1］。β－受体激动剂残留检测手段主要有酶联免疫法(ELISA)［2］、气质联用法(GC－MS)［3，4］、液相色谱串联质谱法(HPLC－MS/MS)［5，6］等，确证方法为GC－MS法和HPLC－MS/MS法。其中ELISA法是初步筛查方法，且专一性强，无法进行多残留同时检测。GC－MS法样品处理需要衍生化，过程较为繁琐。HPLC－MS/MS法是对β－受体激动剂残留定量定性分析的较好手段。本实验应用超高效液相色谱－串联质谱法(UPLC－MS/MS)结合电喷雾离子源(ESI+)和超高压液相色谱柱AcquityBEHC18(2．1mm×50mm，1．7μm)，同时分析猪尿中9种β－受体激动剂残留，实验完成一次分析需12min，缩短了样品分析时间，减少了流动相使用量。UPLC－MS/MS是进行β－受体激动剂残留分析较为理想的仪器。结果表明本方法上机分析时间短，高效快速，灵敏度高;适用于日常抽查猪尿样品的β－受体激动剂残留检测。1实验部分1.1仪器与试剂AcquityUPLC超高效液相色谱仪，Waters公司;MicromassQuattroPremierXE三重四级杆串联质谱

仪配有电喷雾离子源(ESI)，Waters公司;旋转浓缩仪，EYELA公司;Milli－Q超纯水设备，Millipore公司;漩涡混合器，IKA公司;SHA－C恒温水浴振荡器，华峰仪器公司;CT－15RT低温高速离心机，天美公司;OasisMCX小柱，3mL/60mg，Waters公司;微孔滤膜为0．2μm，Pall公司;β－盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，Merk公司。乙酸铵、甲酸、乙酸乙酯、甲醇、乙腈等均为色谱纯;其他试剂均为分析纯。水为超纯水。标准品储备液均用甲醇配制，4℃避光保存(有效期3个月);工作液用水由储备液稀释，现用现配。1.2色谱条件

色谱柱:AcquityBEHC18(2．1mm×50mm，1．7μm);流速:0．20mL/min;柱温:40℃;样品室温度:10℃;进样量:10μL;流动相:溶剂A为0．1%甲酸

乙腈溶液，溶剂B为0．1%甲酸水溶液。梯度洗脱:0min～2min，维持4%A;2min～10min，4%A线性变化至60%A;10min～10．1min，60%A线性变化至4%A;10．1min～12min，维持4%A。1.3质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI);毛细管电压:3．00kV;离子源温度:110℃;锥孔反吹气流量:50L/h;脱溶剂气温度:350℃;脱溶剂气流量:650L/h;碰

撞气:氩气，流量:0．24mL/min，驻留时间50ms;多

63分析仪器2012年第3期反应监测扫描模式(MRM)，其它质谱参数见表1:表1多反应监测扫描模式(MRM)的部分质谱参数化合物定性离子对m/z定量离子对m/z锥孔电压CP(V)碰撞气能量CE(eV)保留时间RT(min)

特布他林226．0＞151．6226．0＞151．625201．83226．0＞124．525西马特罗220．0＞201．9220．0＞201．918101．90220．0＞159．618沙丁胺醇240．1＞147．5240．1＞147．519181．96240．1＞221．910非诺特罗304．2＞106．5304．2＞106．528353．86304．2＞134．620氯丙那林213．8＞153．5213．8＞153．522125．16213．8＞195．811莱克多巴胺302．2＞163．6302．2＞163．620205．19302．2＞106．532克仑特罗277．0＞202．7277．0＞202．725175．72277．0＞258．812妥布特罗227．9＞153．6227．9＞153．623175．74227．9＞171．612喷布特罗292．1＞235．9292．1＞235．930189．04292．1＞200．823

1.4标准曲线绘制分别精密量取适量9种β－受体激动剂标准工作液，得浓度为1、5、10、20、100ng/mL的系列对照溶液，以各特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，对照溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。1.5样品前处理准确移取5mL尿样于50mL离心管中，加入8mL0．2M乙酸铵溶液(pH=5．2)和40μL－盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，漩涡混匀后，置于恒温水浴振荡器中37℃避光振荡16h。取出离心管冷却至室温，用10MNaOH溶液调pH至9．5±0．2，加入乙酸乙酯15mL，剧烈振摇2min，10000r/min离心3min，有机相移入浓缩瓶，继续加入甲基叔丁基醚10mL，剧烈振摇2min，10000r/min离心3min，合并有机相，40℃水浴缓慢浓缩蒸发至干，用2%甲酸溶液5mL溶解，备用。MCX柱依次用3mL甲醇、水、2%甲酸溶液活化，取备用液全部过柱，再

依次用3mL2%甲酸溶液、甲醇淋洗，抽干，用3%氨水甲醇2．5mL洗脱;洗脱液40℃水浴浓缩至干，准确加入0．5mL甲醇－0．1%甲酸溶液(10+90)，漩涡后过0．2μm滤膜上机测定。

2结果与讨论

2.1UPLC-MS/MS分离条件的选择

本实验采用Waters公司的超高压液相色谱柱AcquityBEHC18(2．1mm×50mm，1．7μm)对样品

进行了分离，采用了不同的梯度洗脱程序，在10min内完成对9种β-受体激动剂的有效分离，取得满意结果;同时对各项质谱条件进行了设定(见表1)，使各被测物的响应值达到最佳。图1为9种β-受体激动剂总离子流色谱图。

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分析仪器图19种β-受体激动剂总离子流色谱图图中横坐标为时间(min)，纵坐标为相对丰度(%)。

2.2标准曲线、检出限

2.2.1标准曲线

按照上述方法得出回归方程和相关系数，结果见表2。可以看出9种β－受体激动剂回归方程及相关系数在1～100ng/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数r均大于0．9990。2.2.2检测限

按S/N=3计算，9种β－受体激动剂检测限(ng/mL)分别为特布他林0．14、西马特罗0．087、沙

丁胺醇0．13、非诺特罗0．14、氯丙那林0．094、莱克多巴胺0．067、克仑特罗0．068、妥布特罗0．079、喷布特罗0．037。2.3方法的回收率和精密度

表29种β-受体激动剂回归方程及相关系数药物线性方程r特布他林A=1430．7ρ+1034．10．9999西马特罗A=1471．4ρ+832．00．9990沙丁胺醇A=2298．1ρ+710．80．9998非诺特罗A=582．7ρ+216．00．9997氯丙那林A=2188．0ρ+1781．10．9999莱克多巴胺A=484．6ρ+386．80．9999克仑特罗A=710．8ρ+329．30．9997妥布特罗A=2860．0ρ+1645．20．9998喷布特罗A=1856．2ρ+1008．80．9999

表3猪尿中添加9种兴奋剂类药物精确度测定结果(n=3)(ρ/(ng·mL－1，%)药物标准加入量回收量回收率RSD特布他林21．8894．03．6西马特罗21．8994．54．1沙丁胺醇21．9497．04．7非诺特罗21．9597．51．8氯丙那林21．9497．02．5莱克多巴胺21．9296．03．1克仑特罗21．8291．02．2妥布特罗21．8693．02．9喷布特罗21．9396．53．0

在空白猪尿中添加2ng/mL9种药物进行回收率试验，结果汇总见表3，从中可以看出9种药物平均回收率范围为91．0%～97．5%，RSD范围为1．8%～4．7%。

参考文献［1］农业部公告第193号(食品动物禁用的兽药及其它化

合物清单)2002．［2］李艳，张明洲，陈宗伦，等．猪尿中克伦特罗残留的

ELISA检测研究，浙江农业学报，2006，18(5):328－332．［3］刘维华，谢荣国，陈娟，等．猪尿中"瘦肉精"GC/MS法定量检测及应用，中国饲料添加剂，2007，(5):37－40．［4］农业部1031号公告－3－2008猪肝和猪尿中β－受体

激动剂残留检测气相色谱－质谱法．

83分析仪器2012年第3期