第19卷第1期2003年3月天津理工学院学报JOURNAL OF TIANJIN INSTITUTE OF TECHNOLOGYVol.19N o.1M ar.2003文章编号:1004-2261(2003)01-0030-06脂质体的制备方法及研究进展*曹宁宁,羡菲,刘金鹏(天津理工学院生物与化学工程学院,天津300191)摘要:脂质体是磷脂自聚集而形成的双分子层结构,作为药物载体具有减少药物毒副作用及靶向作用的特点.主要介绍:脂质体3种制备方法物理分散法、两相分散法和表面活性剂增溶法的原理,制备出的脂质体的结构及包封性能和各自的优缺点;脂质体作为药物载体在抗癌、抗菌药物上的应用及其在药物载体方面应用的研究进展.关键词:脂质体;制备方法;药物载体中图分类号:R94文献标识码:APreparation methods of liposome and prospectsCAO Ning-ning,XIAN Fei,LIU Jin-Peng(Colleg e of Biotechnolog y and Chemical Eng.,T ianjin Institute of T echnolog y,T ianjin300191,China)Abstract:Liposomes made from phospholipid sel-f aggregat ion can deduce the drug toxit y and have the same target property as drug delivery system.T he form principles,propert ies,structure and advantages of main three methods are reviewed.T he application prospects of liposome as drug delivery system are mainly introduced.Keywords:liposome;preparation methods;drug delivery syst em自1965年由英国的Bang ham首先发现磷脂在水中可以自发形成脂质体(liposomes)以来[1],对其实验研究日渐广泛,已遍及生命科学及膜工程学等领域,并逐渐向临床应用发展.脂质体是由脂质双分子层组成,内部为水相的闭合囊泡.它的结构类似生物膜,又称人工生物膜,在水中平衡后具有亲水性和疏水性两性性质.脂质体具有以下特征[2~3]:1)脂质体是一种囊泡,2)脂质体的囊泡壁是两层磷脂分子构成,3)脂质体很小一般在1L m以下(1000L m= 1mm),4)磷脂在一定条件下才能形成脂质体,并非把磷脂放在水中就产生脂质体,磷脂在水中或甘油中搅拌只能形成乳化颗粒,5)脂质体包裹其他物质则形成不同内容物脂质体.脂质体的应用范围非常广泛,由于它的磷脂双分子膜与细胞膜结构类似,并且可以通过对其进行修饰,使其具有某些与生物体相似的性质,从而脂质体作为细胞模型,在生物体结构功能研究和模拟等方面具有重要意义[4~5].它的另一个重要的应用是作为药物载体[1].将药物包裹在脂质体的水相和膜相内,控制脂质体的靶向作用使其富集于病变部位将药物释放,从而可以减少所需药物的剂量,也大大避免了药物对人体正常部位的损害.近年来立体稳定脂质体[6]的研制大大提高了脂质体在体内的稳定性,使得脂质体作为药物载体在治疗癌症等疾病方面正在走向实用阶段[7~9].另外脂质体还在太阳能转换、超细微粒制备等方面得到了应用.1脂质体作为药物载体的应用1.1作为抗癌药物的载体由于脂质体对淋巴系统的定向性和对癌细胞的亲*收稿日期:2002-07-05基金项目:天津市高等学校科技发展基金资助项目(20010404)第一作者:曹宁宁(1972)),女,讲师,博士研究生和性,改变了药物在组织中的分布,使药物选择性的杀死癌细胞或抑制癌细胞的繁殖,从而提高疗效,减少剂量,降低毒性,减轻变态和免疫反应.研究表明[10]脂质体猪苓多糖能显著减少黑色素瘤肝转移癌生成作用而空白脂质体和游离态猪苓多糖则无明显作用.1.2作为抗菌,抗寄生虫的药物载体利用脂质体和生物细胞膜亲和力强的特点,将抗生素包裹在脂质体内可增强抗菌效用.如消炎痛制成脂质体后,其抑制角膜穿孔伤炎性反应的作用较混悬水剂明显增强[11].同时由于脂质体和脂复合物或脂分散体的粒子相对于游离的药物来说主要聚集于网状内皮系统,因此可以用来治疗利什曼病等网状内皮系统疾病.同时由于脂质体可以很大程度的降低肾脏的摄取,当二性霉素B制成脂质体后,能显著降低在治疗过程中对真菌感染患者引起的急性肾毒症[12].1.3作为抗病毒药物载体抗病毒药物制成脂质体可显著提高抗病毒疗效,降低了用量和毒副作用.无环鸟苷[13]是一种核苷类抗病毒剂,其水溶性差,将其制成脂质体混悬液后,大大提高其水溶度,降低了用量.2脂质体的制备方法脂质体的制备方法可分为三大类:物理分散法;两相分散法;表面活性剂增溶法.2.1物理分散法物理分散法的基本原理都是将类脂材料干燥成薄膜,然后加入水溶性介质分散,工艺也不复杂,但他们都有一共同的缺点)包封率都较低(微乳化法除外).下面简述一下这些方法.1)手摇法(也称薄膜法):手摇法是脂质体制备方法中最原始,但也是至今为止最基本和应用最广泛的方法[14].类脂材料溶解在有机溶剂中,然后在旋转蒸发器上,在真空下蒸除溶剂,加入缓冲液,再加入一些小玻璃球帮助分散,这样就形成了一个奶白色的分散液.这里应注意的一点是所用的烧瓶应尽量的大些,以便使类脂干燥后形成一层均匀的薄膜,并且使包封体积达到最大值.2)非手摇法:这是一个慢慢水合的方法以提高其包封率[15].在类脂膜形成后,首先将湿的氮气流通过薄膜15m in,然后再加水膨胀、水合,并慢慢搅拌形成脂质体.它的直径可达几百微米,但是只有在无离子和蛋白质时才可形成.3)超声波分散法[16]:水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液,加入磷脂与胆固醇及脂溶性药物共溶于有机溶剂的溶液,搅拌蒸发除去有机溶剂,残留液经超声波处理,然后分离出脂质体.本法制备的大多为单室脂质体,如维生素E脂质体[17]、5-氟脲嘧啶脂质体等[18].4)法兰西加压法:这个方法是用非常高的压力将大的类脂球(M LV)通过一个膜.此法避免了像超声波所引起的降解和不均匀的问题[19].一般这种方法制备的脂质体的粒径在30nm~80nm.将M LV经过1400大气压的法兰西压力筒一次,约600Þ0左右的颗粒直径达25nm~50nm,而通过4次后,约940Þ0的脂质体直径到31.5nm~52.5nm.这个方法比超声波法形成的脂质体粒径稍大些,但与此相比,包封率上升,而渗透性有所下降.5)膜挤压法:降低脂质体的颗粒也可在低压下(小于7个大气压)通过一个滤膜[20].这个方法的优点是可选择膜的孔径,已决定颗粒的大小.而且在经过几次后也较均匀.6)微乳化法:梅赫(M ay hew)等报告了用一个高压均质器从浓的类脂悬浮液中制备小的M LV(也有称为SUV)的方法[21].这个装置可用空气泵或电力/水压增强泵产生非常高的液体压力(可到2100at).利用高压流经过精确规限的微细通道,流体立刻被加速到极高速度,并在特制的专利反应室内产生强大的剪切、冲击及空化作用,形成预期的精细密集及极为均一的脂质体.类脂材料可用MLV悬浮液也可用未水合的类脂浆加入到微乳化其中,经过几次循环,直到达到满意的尺寸为止.一般来说,循环一次后平均直径在100nm ~200nm,确切的方法分布取决于膜的成分及水和介质.这个方法有以下几个优点:重复性好,能大规模生产;微粒均匀稳定性好;包封率高能达到750Þ0.7)预脂质体法:这个方法是通过减少水的量来增加干燥类脂的表面积而发展起来的.将类脂干燥到一个多孔的支持体上(如粉状氯化钠、山梨醇或多糖等[22])然后搅拌下加入少量水以湿润被粉末包覆的干燥类脂.当支持体溶解后,就形成了一个M LV悬浮液.一般这个过程是一点点加水,待水蒸发后再加剩余的水.最后形成一个干燥的类脂.(预脂质体).2.2两相分散法这个方法的基本原理是将类脂剂溶解在有机溶剂中,然后这个油相与水相接触.同时将溶剂蒸发,以变成脂质体.又可分为3种类型:溶剂和水可互溶,(如乙醇注入法);溶剂和水不溶解,但水相过量,(如乙醚注#31#2003年3月曹宁宁,等:脂质体的制备方法及研究进展入法);溶剂和水不溶解,但溶剂过量,(如逆相蒸发法).1)乙醇注入法[23]:将磷脂与胆固醇等类脂质及脂溶性药物溶入乙醇,该溶液经注射器迅速注射到磷酸盐缓冲溶液(或含水溶性药物)中,形成脂质体.直径约25nm.其主要缺点是包封率低,且乙醇很难除去. 2)乙醚注入法[24]:将磷脂与胆固醇等类脂质及脂溶性药物溶入有机溶剂中(多用乙醚),该溶液经注射器缓缓注入加热至50e (并用磁力搅拌)的磷酸盐缓冲溶液(或含水溶性药物)中,不断搅拌至乙醚除尽为止,即得大的多孔脂质体.将其混悬液通过高压乳均机两次,所得成品大多为单室脂质体,少量为多室脂质体,粒径绝大多数在2um 以下.优点是方法较温和,包封率高且被氧化的可能性小,缺点是速度慢不适合大量制备.如头孢菌类脂质体[26]可用此法制得. 3)逆相蒸发法[27]:将磷脂等膜材溶于有机溶剂如氯仿、乙醚等,加入待包封药物的水溶液进行短时超声,直至形成稳定的W/O 型剂,然后减压蒸发除去有机溶剂,达到胶态后,滴加缓冲液,旋转帮助器壁上的凝胶脱落,然后,在减压下继续蒸发,制得水性混悬液,通过凝胶色谱法或超速离心法,除去未包封的药物,即得到大单层脂质体.此法适用于包裹水溶性药物、大分子生物活性物质如各种抗生素、胰岛素免疫球蛋白、碱性磷脂酶、核酸等.2.3 表面活性剂增溶法脂质薄膜、多层脂质体或单层脂质体与胆酸盐、脱氧胆酸盐等表面活性剂混合[27],通过离心法或凝胶过表1 脂质体的制备方法及参数Table 1 Preparation methods and parameters of liposome类别方法直径(L m)包裹体积(l/mol)包裹效率(0Þ0)M LV 手摇法0.4~3.5 3.55~15UVL逆相蒸发法0.2~1.011.735~65乙醚注入法0.1~0.423~3138~46膜挤压法0.2 1.3824.9洗涤剂除去法0.1 2.412.0钙离子熔化法0.2~1.07.010~15S UV超声波法0.025~0.050.8)乙醇注入法0.03~0.110.5 1.0法兰西挤压法0.03~0.08))高压乳化法-0.10.6970滤法或透析法除去表面活性剂,就可获得中等大小的单层脂质体此法适用于制备脂溶性蛋白类药物的脂质体,但这个方法并不作为脂质体的主要制备方法.它的优点是:方法温和,并不产生水解和氧化;表面活性剂/类脂比随意变化,以得到满意的尺寸. 它的缺点是:除去表面活性剂时需要渗析,这一过程需要几个甚至几十个小时.3 脂质体形成原理和脂质的组成3.1 脂质组成各种脂质和脂质混合物均可用于制备脂质体,而磷脂是最常用的[28].磷脂的主要成分是磷脂酰胆碱,磷脂酰乙醇胺,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰甘油,磷脂酸等.其结构可简述为有一个离子型(至少是强极性链)的/极性头0和两条疏水性的高级脂肪烃长链(非极性尾部)组成,在某一特定浓度条件下,其极性头与极性头部分相结合,非极性尾部与非极性尾部相结合,而形成一个稳定的双分子层结构.构成脂质的另一类物质是胆固醇,它在膜中主要起着改变纯磷脂层性质的作用,它像/缓冲剂0一样起着调节膜结构/流动性0的作用.3.2 结合超声波分散法和离心法说明脂质体形成原理如图1所示,加入到磷脂和胆固醇的有机溶剂的水溶液在超声作用下分散为小水滴.磷脂、胆固醇吸附在水滴表面形成一层单分子膜,从而生成油包水(W/O)微乳液.将微乳液转移到缓冲水溶液上后,有机溶剂中多余的磷脂、胆固醇在与缓冲液的油水界面迅速生成一层单分子膜,在离心作用下,油相中的小水滴穿过油水界面的单分子膜并被其包围,在水相中形成脂质体.图1 脂质体的形成原理Fig.1 Formation principle of liposome#32#天 津 理 工 学 院 学 报 第19卷 第1期4脂质体作为药物载体的优点及对其表面修饰的目的脂质体作为一种内层含有水相的封闭的圆球型双层膜,用于药物释放系统,具有两个独特的优点:1)可以在其内水相包封水溶性药物,也可以在外层双层膜包封脂溶性药物;2)它和天然生物膜的生物相溶性比较好,在药物学应用中,安全性可靠.然而,脂质体不论其组成、尺寸大小和表面所带电荷如何,它都能够在静脉给药1h 后被网状内皮系统(RES)截留[29].因此,对脂质体进行表面修饰的主要目的是:(1)延长脂质体的半衰期和提高它在血液循环中的稳定性;(2)改变脂质体的生物学分布;(3)产生靶向效应;(4)使脂质体具有独特的性能,如使它具有对pH、温度和光等外界刺激产生敏感性.5种新型脂质体1)温度敏感脂质体:脂质膜在由/凝胶态0转到液晶结构时,其磷脂的脂酰链紊乱度及活动度增加,膜的流动性也增大,此时包封的药物的释放速率亦增大,此温度称为脂质体的相变温度.根据这一原理制备的脂质体成为温度敏感脂质体.2)pH敏感脂质体:根据肿瘤附近的pH值比周围正常组织低的事实,设计了pH敏感脂质体.其原理是pH低时可导致脂肪酸羧基的质子化而引起六方晶体(非相层结构)的形成.而它的形成则是膜融合的主要机制.如白喉霉素A pH敏感脂质体,DNA pH敏感脂质体.3)免疫脂质体:免疫脂质体是机体修饰的脂质体的简称.近年来,将癌细胞当作抗原细胞,使产生对抗这种癌细胞的单体,然后将这种抗体结合到脂质体上,从而使这种脂质体能够将药物定向输送到癌细胞,起到良好的疗效.4)掺入糖脂的脂质体:将糖脂链的一部分用棕榈酰或具有适当间隔基的胆淄醇基取代得到糖类衍生物,再与含药脂质体混合,在适当的条件下孵育,即得到掺入糖脂的脂质体.这种脂质体可改变其在组织内的分布,且稳定性好.5)前体脂质体:前体脂质体通常为干燥,具有良好流动性能的颗粒或粉末,贮存稳定,应用前与水水合可分散或溶解成等张的脂质体,这种脂质体解决了稳定性和高温灭菌等问题,为工业生产奠定了基础.6)聚合脂质体:聚合脂质体是构成脂质体的每个类脂分子通过共价键的形式连接起来的一种新型脂质体,通过共价键把脂质体的双分子膜与表面活性剂分子连接起来.可显著提高其稳定性,降低粒子的融合与聚集,使脂质体中药物渗漏显著降低,延长了有效期.7)磁性脂质体:磁性脂质体是在脂质体中掺入铁磁性物质制成.8)声振波敏感脂质体:将含有声振波敏感分子的脂质体药物给予患者,在其体外施声振波于所选择的靶位区域,使药物在脂质体内释放出,以增加组织细胞对药物的摄取,使靶位的药物浓度升高,从而降低全身毒性.9)光敏脂质体:光敏脂质体是将光敏物质的药物包裹在脂质体内,用来进行光学治疗,当在一定波长的光照射时,脂质体膜与囊泡物质间或脂质体之间发生融合作用而释放药物.无论是何种脂质体,都可分为3种类型:小单层状囊;大单层状囊和多层状囊.这3种类型的脂质体各有优缺点.各种类型脂质体的性能比较见表2.表2不同类型脂质体的性能比较结果Table2Performance of different type of liposome 脂质体种类优点缺点多层状囊的包封体积大,包封性能好,稳定相当好形状大小不均匀,难包封聚合物;很难有效地将包封物输送入皮肤细胞小单层状囊的形状大小均匀包封的有效体积较小,难包封聚合物,容易出现互溶现象.大单层状囊的能包封聚合物,包封的性能好,包封的体积大大小不均匀6脂质体研究展望研究证实,利用神经甘酯[30]或者聚乙二醇(PEG)衍生物对脂[31~34]质体进行表面修饰可以提高其稳定性.另外,Sunamoto等人[35~37]也利用多糖衍生物包覆脂质体,能够有效地延长脂质体的体内循环时间.除此之外,一系列的生物相容性合成高分子,无论是中性的或是荷电的,都已被用于提高脂质体的稳定性而得到较多的研究.近期的研究工作证实,高分子作为脂质体的包覆材料不仅只是扮演一个被动的保护角色,而且可能在实际上通过接受外来的刺激而参与控制药物的#33#2003年3月曹宁宁,等:脂质体的制备方法及研究进展释放过程.今后随着科学技术的发展和脂质体生产工艺研究的深入,相信会创造出更多更好的新型脂质体,使脂质体得到更广泛的应用.参考文献:[1]Bangham A D,Standish M M,Watkins J C.Diffussion ofunivalent inos across the lamella of swollen phospholipids [J].J.M ol.Biol.1965,13:238)252.[2]M artin C,Woodle,Danilo D L asic.Sterically stabilizedliposomes[J].Biochimica et Biophysica Acta,1992,1113:171)199.[3]王闻珠,邓英杰.脂质体肺部给药研究进展[J].沈阳药科大学学报,2000,17(3):226)229.[4]Lasic D D.L iposomes.From Physics to Application[M].Elvev ier:Amsterdam,1993.[5]Gregoriadis G.Liposome T echnology[M].Boca Rato n:CRC Press;1984.[6]牛荣丽,李志良.阿苯达唑免疫脂质体的制备[J].新疆医科大学学报,2001,24(1):659)661.[7]陈忠斌,王升启,王弘,等.pH敏脂质体对反义寡核苷酸康流感病毒活性的影响[J].中国生物化学与分子生物学报,1999,15(4):553)557.[8]石丽萍,颜光涛,李英丽,等.酸敏脂质体的制备及其在肠缺血-再灌注小鼠体内重要脏器中的分布[J].中华危重病急救医学,2001,13(11):659)661.[9]邹一愚,顾学裘,崛越勇.肝动脉注射阿霉素温度敏感脂质体的制剂研究[J].药学学报,1991,26(8):622)626. [10]张中冕,段方龄,张明智.脂质体猪苓多糖抗肝转移癌作用的研究[J].白求恩医科大学学报,1999,8(3):180)182.[11]吕延长,母敬郁,王友联,等.消炎痛脂质体对兔角膜穿孔伤的疗效观察[J].白求恩医科大学学报,1997,23(2):139)140.[12]郭宁如,吴绍熙.二性霉素B脂质体的研究与应用[J].中国新药杂志,1996,5(4):264)265.[13]周青.无环鸟苷脂质体混悬液的分析[J].中国医院药学杂志,1997,17(3):115)116.[14]W ang C Y,Yughes K W,Huang L.Improvedcytoplasmic delivery to plant protoplasts via PH-sensitiveliposome[J].Plant Physiol,1986,82:179)186.[15]Ropert C,M alvy C,Couvreur P.Inhibit ion of the fr iendretrovirus by antisense oligonucleot ide encapsulat ed inliposome:mechamism of action[J].P harm Res,1993,10(10):1427)1433.[16]郭健新,平其能,黄罗生.柔性环孢素纳米脂质体的制备及其变行性[J].中国药科大学学报,1999,30(3):187)191.[17]李国锋,周日红,曾抗,等.维生素E脂质体的制备[J].中国应用药学,1997,14(4):18)20.[18]肖旭.5-氟脲嘧啶温度敏感性脂质体制备方法的优化[J].药学实践杂志,1998,16(6):344)346.[19]T ari A M,T ucher S D,Deisser oth A,et al.Liposomedeliv er y of methyphosphonate antisenseoligo deoxynucleotide in chromic myelogenous lerkemia[J].Blood,1994,84(2):601)607.[20]M a D D F,Wei A Q.Enhanced delivery of syntheticoligonucleotides to huaman leukaemic cells by liposomesand immunoliposomes[J].L eukemia Research,1996,20(11~12):925)930.[21]K remer J M H.V esicles of variade diameter by a modifiedinject ion method[J].Biochemistry,1977,16(17):3932)3935.[22]阎家麟,童岩,王九一.紫杉醇脂质体的制备即其抑瘤作用的研究[J].药物生物技术,1996,3(3):1) 5. [23]Szoka F,O lsom F.Preparation of liposo me o f inter mediasize by a combination of reverse phase evaporation andextr usion through polycarnonate membranes[J].BiochemBiophys Acta,1980,601:559)571.[24]全东琴,苏德森,顾学裘.药物载体空白脂质体前体的制备及性质的研究[J].沈阳药科大学学报,1999,16(3):160)164.[25]张根旺,刘晓见.脂质体化妆品及其应用[J].郑州工程学院学报,2000,21(12):4)8.[26]Senior J H.Fate and behavior of liposomes in vivo:ar ev iew of co ntrolling factors[J].T her.Drug Carr ierSyst.,1987,3:123)193.[27]Allen T M,Chonn rge unila mellar liposomes w ith lowuptake into the reticuloendothelial system[J].FEBS L ett.,1987.223:42)46.[28]K libanovA l,M ar uyama K,T orchilinV P,et al.Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong thecirculation time of liposomes[J].FEBS L ett.,1990,268:235)237.[29]M or i A,K libannov A L,T o rchilin V P,et al.Influence ofster ic barrier activity of amphipathic poly(ethyleneglycol)and ganglioside GM1o n the circulat ion time of liposomesand on the target binding of immunoliposomes in v ivo[J].F EBS L ett.,1991,284:263)266.[30]Woodle M C,Lasic D D.Ster ically stabilized liposomes[J].Biochim.Biophys Acta,1992,1113:171)199. [31]T orchilin V P,K libanov A L,Huang L,et al.T ar getedaccumulation of poly ethyleneg lycol-coatedimmunoliposomes in infr acted rabbit myocardium[J].FASEBJ,1992,6:2716)2719.[32]SunamotoJ,Sato T,T aguchi T,et al,N aturally o ccurr ingpolysacchar ides deriv at ives w hich behave as an artificial cell#34#天津理工学院学报第19卷第1期wall on an ar tificial cell liposome[J].M acromolecules,1992,25:5665)5670.[33]Baszkin A,Rosilio V,A lbrecht G,et al.Cholesteryl-pullulan and cholesteryl-amylopectin interact ions w ithegg phosphatidy lcholine monolayers[J].J.ColloidI nterface Sci.,1991,145:502)511.[34]Sunamo to J,Sato T,Hiro ta M,et al.A newly developedimmunoliposomes an egg phosphatidylcholine liposomecoated w ith pullulan bearing both a cholesterol moiety andan IgM s frag ment[J].Biochim.Biophys.Acta,1987,898:323)330.[35]Ozden M Y,Hasir ci V N.Enzy me im mobilizatio n inpolymer-coated liposomes[J].Br itish Poly m.,J.,1990,23:229)234.[36]Ishihara K,Nakabayashi N.Specific interaction betw eenwate-r soluble phospholipi polymer and liposome[J].J.Polm.Sic:Po lym.chem.,1991,29:831)835.[37]T omas J L,Y ou H,T irrell D A.T uning the response o f apH-sensit ive membrane switch[J].J.Am.Chem.Soc.1995,117:2949)2950.(上接第12页)5结论通过在终端系统建立一种高效的、扩展性好的、能够支持数据密集和通信密集应用的底层基础结构,并在上层网络系统将CORBA与Web的结合,大大方便了WWW应用的开发、发布和维护,有助于在WWW 上建立分布式对象环境,推动WWW进入动态的应用阶段,从而极大地提高了WWW的发布能力,实现各种高级服务策略.基于该混合模式的系统将实现资源的管理和分配、通信、安全机制、统一的资源信息服务、提供远程数据访问等功能,使传统诊断技术能够在网络上得到充分发挥,并为故障诊断技术开创了新的研究方向.参考文献:[1]季立明.基于网络的设备监测诊断开放平台的研究[D].天津:天津大学,2002.43)67.[2]胡春华,朱庆华,张智勇,等.基于COR BA的分布式网络化制造系统建模[J].机电一体化,2001,(2):16)20. [3]吴伟蔚,杨叔子.故障诊断Ag ent研究[J].振动工程学报,2000,13(3):393)399.#35#2003年3月曹宁宁,等:脂质体的制备方法及研究进展。
