基因工程菌的发酵及偶氮染料脱色研究_金玉洁
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基因工程菌的发酵及偶氮染料脱色研究
金玉洁 金若非 王竞 周集体
(大连理工大学环境工程系 辽宁大连116024)
摘 要 考察了本实验室自行构建的基因工程菌pGEX-AZR/E.coliJM-109的培养条件(碳源、氮源及其量的选择,接
种量、温度、pH值);并考察其偶氮染料脱色能力范围。 关键词 基因工程菌 发酵 偶氮染料 脱色
ResearchesontheFermentationofGeneticEngineeringMicroorganismandtheDecolorizationofAzodyes
JinYujie JinRuofei WangJing ZhouJiti
(Dept.ofEnvironmentalEngineering,DalianUniversityofTechnology Dalian,Liaoning116024)Abstract Thefermentationconditionsofgeneticengineeringmicroorganismconstructedbyourowninthelaboratoryarestudiedinthispa-per,inwhichtheconditionsincludecarbonsource,nitrogensource,thequalitiesofcarbonandnitrogensource,inoculation,temperatureandpHvalueandthedecolourizationabilityofazodyesisalsoresearched.Keywords geneticengineeringmicroorganism fermentation azodyes decolourization
偶氮染料及其降解产物多具有致癌作用,并能在环境中
长期存在,因此上述行业向环境中排放的含偶氮化合物的废
水成为废水处理中的焦点问题。传统的处理方法通常难以
使受偶氮染料污染的废水有效地脱色。构建基因工程菌治
理环境污染[1],是环境微生物工程高新技术中的前沿课题。
它能定向有效地利用环境微生物细胞中降解污染物的基因,
去执行净化污染物的功能。
目前国内外关于基因工程菌应用的报道并不少见,但是
关于降解偶氮染料基因工程菌的,本文是第1例。笔者研究
了基因工程菌E.coliJM109的发酵条件,并考察其降解偶
氮染料的能力。
1 材料与方法
1.1 工程菌
pGEXAZR/E.coliJM109(pGEX4T1和偶氮还原酶
基因连接的)由本实验室构建保存。
1.2 试剂
酵母膏,蛋白胨,Na2Cl,Na2HPO4KH2PO4,MnSO4#7H2O,
FeSO4#7H2O,MgSO4#7H2O,CaCl2,NH4Cl,Glucose。(上述化学
试剂均为分析纯)。
所用染料:酸性橙Ò,酸性黑10B,酸性红6B,酸性红G,
酸性红GR。
1.3 培养基
种子培养基:LB[NaCl10g/L,蛋白胨10g/L,酵母膏
(4e保存)5g/L]。
固体培养基:NaCl10g/L,蛋白胨10g/L,酵母膏(4e保
存)5g/L,琼脂20g/L。
发酵培养基:Na2HPO44.26g/L,KH2PO42.65g/L,MnSO4#7H2O0.002g/L,FeSO4#7H2O0.01g/L,MgSO4#7H2O0.2g/L,CaCl20.02g/L,NH4Cl3g/L,Glucose5g/L。1.4 工程菌的培养
将甘油保存菌种接种于LB平板培养基上,37e过夜培
养;挑取单菌落接种于新鲜液体培养基中,37e过夜培养;培
养液作为种子,按1%接种量接种于100mL发酵培养基,于
30e、150r/min摇床内培养至菌体浓度A660nm0.5~0.8,添加
诱导剂IPTG诱导表达。本研究采用250mL摇瓶培养法优
化工程菌的主要发酵仪器。
1.5 工程菌的稳定性
在LBAmp.固体LB平板培养基上划线接种工程菌E.
coliJM109,在30e培养48h后单挑菌落继续划线培养,每
转1次记为1代。在转接到第30代时将单菌落挑取置于LB
Amp.液体培养基中,于30e、150r/min的摇床内,经24h
培养测定OD660。
1.6 发酵培养基的选择
1.6.1 无机盐的选择
A:KH2PO40.5g/L,NaNO31.0g/L,MgSO4#7H2O0.5g/L,
KCl0.5g/L,(NH4)2SO40.6g/L,Glucose1.25g/L,Amp.
50mg/L。
B:Na2HPO44.26g/L,KH2PO42.65g/L,MnSO4#7H2O
0.002g/L,FeSO4#7H2O0.01g/L,MgSO4#7H2O0.2g/L,CaCl20.02g/L,NH4Cl0.5g/L,Amp.50g/L。
C:NaCl5g/L,(NH4)2SO41g/L,MgSO4#7H2O0.25g/L,
NaNO32g/L,KH2PO44g/L,K2HPO4#3H2O10g/L,Glucose
12.5g/L,Amp.50mg/L。
培养基A、B及C中E.coliJM109工程菌12h生长结
论如表1,培养基种类对菌密度的影响见图1。
表1 E.coliJM109工程菌的密度对比
菌代13050OD6601.6321.6021.621#10# 工业安全与环保 IndustrialSafetyandEnvironmentalProtection 2005年第31卷第9期September2005
图1 培养基种类对菌密度的影响1.6.2 菌体生长的测量
菌体干重x(g/L)与菌液浊度OD(660nm)存在线性关
系[2],经实验得OD=2.2529x+0.0469(R2=0.9909)。取
培养的菌液3mL,其中1.5mL溶液离心(8kr/min)10min后
的上清液作为参比,测量另外1.5mL溶液660nm下的吸光
度,作为生物密度的定量数据。
1.7 缺氧脱色
在好氧条件下培养菌体,菌体诱导生长到OD660=1.0
时投入密闭反应瓶,此时加入染料使其质量浓度为5@
10-5,然后监测染料的脱色情况。
2 结果与讨论
2.1 碳源的影响
碳源的主要作用是构成微生物细胞的含碳物质和供给
微生物生长、繁殖及运动所需要的能量。在选定的无机盐培
养基中按碳源5g/L加入葡萄糖、淀粉、乳糖、果糖、甘油及
蔗糖作为碳源。结果见图2。
图2 碳源对菌体生长的影响由图2知,菌体在不同碳源中的长势如下:甘油>蔗糖
>乳糖>葡萄糖>淀粉>果糖。相比较下,E.coliJM109
工程菌在以甘油为碳源的培养基中长势最好,但甘油价格较
贵;蔗糖为碳源,菌体生长启动期长;乳糖还可用作诱导
剂[3]。因此,实际发酵中以葡萄糖为碳源。
2.2 氮源的影响
氮源的作用是提供微生物合成蛋白质的原料。分别加
入5g/L的NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素(脲)、草酸铵及蛋白胨于
30e,150r/min摇床中培养,进行氮源选择。结果如图3所
示。蛋白胨作为氮源时,菌体生长情况最好。但由于蛋白胨
是一种复合营养物质,其中的成分比较复杂,且价格昂贵,所
以不予采用。其余4种氮源之中加入NH4Cl的E.coliJM
109的长势好于其他,所以采用NH4Cl作为氮源。
2.3 碳源用量的影响从图4中看出,菌体在葡萄糖用量为5g/L时生长状态
最佳。葡萄糖的用量不是越大越好,这可能是由于葡萄糖发
酵的产物是乙酸[4],而乙酸是菌体代谢的产物,会抑制菌的
生长。
图3 氮源对菌体生长的影响
图4 葡萄糖用量对菌体生长的影响2.4 氮源用量的影响
从表2可知,NH4Cl对菌体生长无明显影响,实际发酵
中采用3g/L。
表2 NH4Cl用量对E.coliJM109生长的影响
NH4Cl/(g#L-1)234567
干重/(g#L-1)0.3640.3680.2930.3660.3560.351
2.5 pH的选择
微生物的生命活动、物质代谢与pH值密切相关。pH值
对E.coliJM109的影响如图5所示。
图5 pH值对菌体生长的影响从图5看出,在pH值为7或7.5时菌体的干重都较高,
但生长前期菌体在pH=7的培养基生长的情况较好,而后期
在pH=7.5的培养基生长占优。分析原因为E.coliJM109
生长过程中产生的代谢产物乙酸及CO2降低了培养基的pH
值,所以后期pH值较高的培养基中生长情况较好。
2.6 接种量的影响#11#从图6可以看出,接种量大时,初始菌密度比较大,但最
后趋于一致,可能是由于培养基的养料是一定的,只能供给
菌体长到干重0.5~0.6。
图6 接种量对菌体生长的影响2.7 温度的影响
温度是微生物的重要生存因素。实验在温度为30e、
35e、40e下进行,结果如图7。
图7 温度对菌体生长的影响
从图7中可以看出,温度35e时,菌体的生长状况最好。
在适宜的温度范围内,温度每升高10e,酶促反应速度将提
高1~2倍,微生物的代谢速率和生长速率均可相应提高。
适宜的培养温度可使微生物以最快的生长速率生长。温度
过高或过低均会降低代谢速率及生长速率。
2.8 E.coliJM109工程菌降解偶氮染料 在缺氧条件下,考察了JM109对不同染料的脱色能
力,染料质量浓度为5@10-5。由图8可见E.coliJM109工
程菌对多种偶氮染料有较好的脱色效果,且染料分子量小的
脱色率大。图8 E.coliJM109工程菌降解偶氮染料
3 结论
(1)B为最佳无机盐培养基,成分:Na2HPO44.26g/L,
KH2PO42.65g/L,MnSO4#7H2O0.002g/L,FeSO4#7H2O
0.01g/L,MgSO4#7H2O0.2g/L,CaCl20.02g/L,NH4Cl0.5
g/L,Amp.50mg/L。
(2)最佳碳源、氮源分别是葡萄糖(5g/L)、氯化铵(3g/L)。
(3)pH=7.5,温度为35e时菌体生长最好。
(4)接种量对菌体生长影响不大。
(5)工程菌对多种偶氮染料有很强的脱色能力,分子量
小的脱色率高。
参考文献
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3 NeubauerP,HofmannK,HostO,etal.MaximizingtheexpressionofarecombinantgeneinEscherichiacolibymanipulationofinductiontimeusinglactoseasinducer.ApplMicrobiolBiotechnol,1992,36(6):7397444 吴军,于公义,冯尔玲.乙酸积累对基因工程菌培养的影响及培养基pH的关系.微生物学报,1996,36(6):433
