RP-HPLC法测定满山香中槲皮素和山奈素的含量
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ＲＰ－ＨＰＬＣ法测定满山香中槲皮素和山奈素的含量
摘 要:目的：建立同时测定满山香中槲皮素和山奈素两种黄酮含量的反相高效液相色谱系统。方法：Agilent C18(250mm×4.6mm)柱，以甲醇-水-磷酸（500：500：1）为流动相；流速：1ml/min；检测波长：360nm;柱温：30℃。结果：该法线性关系良好，槲皮素的平均回收率为98.4%，RSD为1.67%。山奈素的平均回收率为97.7%，RSD为2.28%。结论：本方法可靠，准确，分离度好，可用于满山香的质量控制和评价。
关键词：满山香；槲皮素；山奈素；RP-HPLC;质量控制
满山香为报春花科植物细梗香草Lysimachia capillipies Hemsl的干燥全草，具有祛风，止咳，调经等功效，临床主要用于感冒咳嗽，气管炎，哮喘，月经不调，神经衰弱等［1］。从细梗香草中分离得到香草内酯、香草素、胡萝卜苷、琥珀酸、槲皮素、3，4，5，5，7-五羟基黄酮、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和山奈素［2］，还含有挥发油。本实验同时对满山香中的山奈素和槲皮素进行了HPLC含量测定,提供了一种更为合理的满山香质量标准控制方法。
1 仪器与试药
Agilent-1200高效液相色谱仪（Agilent化学工作站、UV检测器、四元泵）、arium○R611UV型超纯水系统（德国Sartorius公司）、KQ-250超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）、山奈素对照品（中国药品生物制品检定所，0861-200002）、槲皮素对照品（中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，1078-050205），甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。满山香经江西中医学院药用植物教研室赖学文教授鉴定为报春花科植物细梗香草Lysimachia capillipies
Hemsl的干燥全草。
2 方法与结果
2.1 色谱条件:色谱柱
Agilent C18(250mm*4.6mm);流动相：甲醇-水-磷酸（500：500：1）；流速：1ml/min；检测波长：360nm;柱温：30℃。在此条件下槲皮素在约9.4min有一色谱峰，山奈素在约16.2min有一色谱峰，见图1，2。
2.2 对照品溶液制备
精密称取经五氧化二磷干燥过夜的山奈素（K）对照品4.92mg,槲皮素(Q)对照品0.9mg置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度。摇匀，作为对照品贮备液。（Q为90ug/ml,K为492ug/ml）。
2.3 供试品溶液制备
取满山香粉末1.0g粉末，精密称定，置索氏提取器中，加50%甲醇60ml，回流提取3h，加盐酸0.5ml在水浴上微沸回流30min，挥干，用约10ml甲醇溶解与15g硅胶搅拌均匀，直至甲醇挥干，装柱，用50ml石油醚洗脱，弃去石油醚液，再以100ml氯仿：甲醇（4：1）液过柱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解并加至5ml,摇匀，即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系考察
精密量取上述储备液0.2ml、0.4ml、0.8ml、1ml、2ml、4ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释成10ml,分别吸取10ul，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定对照品峰面积。将山奈素浓度与槲皮素溶度与峰面积进行回归处理，回归方程分别为：槲皮素（Q）：Y=86.388X-5.4903，R=0.9998,线性范围为：3.6~72ug/ml；山奈素（K）:Y=71.307X+21.155,R=0.9999,线性范围为：19.68~393.6ug/ml。结果表明槲皮素（Q）与山奈素（K）分别在3.6~72ug/ml与19.68~393.6ug/ml范围内，对照品进样量与其峰面积积分值具有良好的线性关系。
2.4.2 稳定性试验
精密吸取供试品溶液10ul，按上述色谱条件，在0、0.5、1、2、3、4h测定槲皮素（Q）与山奈素（K）峰面积值，结果槲皮素（Q）与山奈素（K）RSD分别为2.61%与2.76%（n=6）。
2.4.3 精密度试验
精密吸取标准品溶液10ul，按上述色谱条件，重复进样5次，测定槲皮素（Q）与山奈素（K）峰面积值，结果槲皮素（Q）与山奈素（K）RSD分别为2.74%与2.82%。
2.4.4 重现性试验
取同一样品，共6份，制成供试品溶液，按上述色谱条件进行测定结果槲皮素（Q）与山奈素（K）含量，计算，结果RSD分别为2.34%与1.82%。
2.4.5 加样回收率试验
精密称取同一样品满山香粉末0.5g，共5份，置索氏提取器，各精密加入槲皮素（Q）与山奈素（K）对照品溶液（Q：33ug/ml，K：812ug/ml）1ml，加50%甲醇提取3h,余同“供试品溶液的制备”项下操作，制成供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，计算回收率，结果
平均回收率分别为98.4%与97.7％，RSD为1.67％与2.28％。
2.5 样品测定
精密称取不同产地满山香药材，照“供试品溶液的制备”项下方法制备，精密吸取上述对照品溶液与各供试品溶液10ul,注入液相色谱仪，测定，结果槲皮素（Q）与山奈素（K）的分别含量为0.0061％与0.107％。
3 小结
3.1 提取溶剂选择
分别选择了甲醇、50%甲醇、80%甲醇作为提取溶剂，槲皮素含量测定结果表明：50%甲醇甲醇＞80%甲醇，山奈素含量测定结果表明：甲醇≥50%甲醇80%甲醇，因此，综合考虑，选用50%甲醇时，峰形最好，且目标物含量较高，故选用甲醇作为该方法的提取溶剂。
3.2 提取方法选择
分别选择了3种提取满山香粉末的方法，即超声30min、索氏提取3h、回流提取1h,槲皮素含量测定结果表明：索氏3h超声30min≥回流1h,山奈素含量测定结果表明：超声30min≥索氏3h回流1h，因此，综合考虑，选用索氏提取3h时，峰形最好，且目标物含量较高，故选用索氏提取3h作为该方法的提取方法。
3.3 分离方法选择
分别选择了聚酰胺过柱，石油醚、乙酸乙酯萃取分离，硅胶过柱3种分离方法，槲皮素含量测定结果表明：硅胶过柱分离聚酰胺过柱分离＞石油醚、乙酸乙酯萃取分离，山奈素含量测定结果表明：硅胶过柱分离≥聚酰胺过柱分离石油醚、乙酸乙酯萃取分离，因此，综合考虑，选用硅胶过柱的分离方法，具有峰形较好，且目标物含量较高，故选用硅胶过柱作为该方法的提取方法。
参考文献：
［1］ 江西省卫生厅.江西省中药材标准［M］.南昌：江西科学技术出版社，1996.
［2］ 谢忱，徐丽珍，赵保华.细梗香草化学成分的研究［J］.中草药，2000，
31（2）：81-83.
