拟南芥中一个锌指蛋白AT5g47610的基因克隆及表达分析

问题探讨 陈 存等:拟南芥中一个锌指蛋白A T5g 47610的基因克隆及表达分析㊃问题探讨㊃收稿日期:2018-12-15基金项目:四川省科技厅应用基础项目(2017J Y0178);四川省教育厅科研项目(17Z B0071);国家自然科学基金(31560402,31760398)㊂作者简介:陈 存(1986 ),女,四川遂宁人;硕士,讲师,主要从事植物遗传与分子生物学研究;E -m a i l :c h e n c u n 0211@126.c o m ㊂通讯作者:蔡 菁(1983),女,陕西宝鸡人;博士,实验师,主要从事实验教学研究;E -m a i l :c a i j i n g@s c u .e d u .c n ㊂拟南芥中一个锌指蛋白A T5g 47610的基因克隆及表达分析陈 存1, 高志宏3, 冯媛媛1, 伍 勇1, 祁伟亮1, 陈 成1,陈 洁1, 伍林涛3, 奉 斌4, 蔡 菁2(1.成都师范学院化学与生命科学学院, 成都611130; 2.四川大学华西药学院, 成都610064;3.贵州省农业科学院油菜研究所, 贵阳550008;4.贵州省农业科学院油料研究所, 贵阳550006)C l o n i n g a n dE x p r e s s i o nA n a l y s i s o f aR I N G -f i n ge r P r o t e i nA T5g 47610i nA r a b i d o ps i sT h a l i a n a C H E NC u n 1,G A OZ h i h o n g 3,F E N GY u a n y u a n 1,W UY o n g 1,Q IW e i l i a n g 1,C H E NC h e n g 1,C H E NJ i e 1,W UL i n t a o 3,F E N GB i n 4,C A I J i n g2摘 要:逆境胁迫是植物正常生长发育与作物产量提高的重要限制因素,具有锌指结构的E 3泛素连接酶作为一个重要的蛋白家族,在植物逆境胁迫应激中起着重要的调控作用㊂本文从一个含有锌指结构的蛋白A T5g 47610出发,通过P C R 对其基因进行克隆,然后连接到P E T32a 原核表达载体,37ħ通过0.2mMI P T G 诱导出了目标蛋白,为后续的蛋白功能鉴定研究奠定了基础㊂关键词: E 3连接酶;基因克隆;诱导表达D O I 编码: 10.16590/j .c n k i .1001-4705.2019.04.081中图分类号: Q943.2 文献标志码: A 文章编号: 1001-4705(2019)04-0081-04随着全球变暖,极端气候事件发生日趋频繁,尤其是高温干旱等极端气候事件,近几十年在我国发生的频率和强度增加异常显著[1]㊂高温㊁干旱等非生物胁迫会引起植物的形态㊁生化㊁生理和分子等方面发生变化,并导致植物的产量下降[2-4],对农业造成的损害在世界范围内都非常广泛㊂植物在胁迫条件下,能够感知并传导逆境信号,启动相关基因的表达,从而激活相应的保护代谢途径,如气孔关闭㊁脱落酸(A B A )含量增加㊁抗氧化酶含量改变等㊂现已发现很多在胁迫应答信号中起作用的基因,一般按功能分为两类:一类是功能蛋白,包括糖转运子㊁水通道蛋白㊁抗冻蛋白和分子伴侣等,能够直接提高植物的抗逆能力;另一类是调节蛋白,包括不同家族的转录因子㊁磷酸酶㊁蛋白激酶和E3泛素连接酶等,主要参与调控胁迫的信号转导以及与胁迫相关基因的表达[5-6]㊂而对调节蛋白的研究,以转录水平调控居多[7],至于翻译后水平调控(主要包括磷酸化和泛素化修饰)机制研究得还不透彻,是目前植物应对胁迫调控机制研究的热点内容㊂其中泛素化修饰参与调控细胞生命活动的各个生理代谢过程,在细胞生命活动中发挥着至关重要的作用,特别在植物响应外界非生物胁迫的过程是不可缺少的,因此近年来引起了越来越广泛的关注[8-9]㊂ 泛素依赖的蛋白酶体途径由泛素激活酶E1㊁泛素结合酶E 2和泛素连接酶E3顺序催化完成,目前,已发现了一些泛素E 3连接酶能够决定靶蛋白的特异性识别,参与植物的逆境胁迫,在泛素途径中具有重要作用[10-12]㊂筛选与鉴定拟南芥中与高温㊁干旱相关的E 3连接酶,分析其抗逆机制,将有助于通过基因工程手段选育耐热耐旱的植物新品种,提高高温干旱地区的农业生产力,具有重要的现实意义㊂本研究对拟南芥中具有锌指(R I N G -f i n g e r )结构,可能具有E3泛素酶活性,并在耐热方面起有一定作用的A T5g 47610进行了基因克隆及表达分析,为进一步鉴定其功能奠定基础㊂1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 植物材料野生型拟南芥(A r a b i d o ps i s t h a l i a n a )C o l u m b i a (C o l .)生态型为本实验室保存㊂1.1.2 菌株㊁载体 菌株:E .c o l i J M109,用于A T 5G 47610基因载体的构建及克隆;E .c o l i B L 21:用于原核表达㊂均为本㊃18㊃种 子 (S e e d )第38卷 第4期 2019年4月V o l .38 N o .4 A pr . 2019实验室保存㊂载体:P E T32a,为本实验室保存㊂1.1.3 化学及分子生物学试剂高保真P f uD N A 多聚酶㊁d N T P 混合物㊁限制性内切酶(B a m H1㊁S a c 1)均购自F e r m e n t a s (M B I)公司;T4D N A 连接酶㊁2000b p DN A L a d d e r M a r k e r 购自T a k a r a 公司;D N A 胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自T i a n ge n 公司㊂1.2 实验方法1.2.1 引物设计根据在N C B I 上查到的A T5G47610的c D N A 序列,使用p r i m e r 5.0设计引物㊂引物序列为:U P :5 C G G G A T C C A A G A T G C G T T T G C T A G -T A G C A G3d o w n :5 C G A G C T C G T G G C T T G A A G G A G T TT C A G A G T31.2.2 R N A 提取及反转录为c D N A 参照张年辉[13]的方法稍作改动提取拟南芥总R N A ,利用R T -P C R 制备拟南芥c D N A ,反应体系(20μL ):反应体系反应体积/μL5ˑR Tb u f f e r 4d N T P2S u pe rR I 0.5R T -E n h a n c e r0.5R a n d o m P r i m e r 1O l i god T 1模板(R N A )4R e v e rA c e 1d d H 2O6反应程序:30ħ,10m i n ;42ħ,30m i n ;99ħ,5m i n ;4ħ,5m i n ㊂1.2.3 A T5G47610基因的扩增和纯化以拟南芥c D N A 为模板,构建P C R 反应体系(25μL ):反应体系反应体积/μL10ˑp f uB u f f e r (含M g S O 4)2.5d N T P2U p Pr i m e r 1D nP r i m e r1模板(c D N A )2T a q 酶(5U ㊃μL -1)0.5d d H 2O16 P C R 循环参数:94ħ变性2m i n ;然后进行31个P C R 循环(94ħ变性30s ,54ħ退火30s ,72ħ延伸50s );最后继续在72ħ延伸10m i n ,16ħ保存㊂P C R结束后,将扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,5V ㊃c m -1电泳18m i n 后,放入凝胶成像系统中观察是否有目标条带㊂按上述已摸索好的反应条件配制10组相同的P C R 体系,扩增后将10组合为一管用于后续的纯化㊂配制大孔的2%琼脂糖凝胶用于胶回收㊂从琼脂糖凝胶上切下含目的基因片段的凝胶,按照T i a n g e n 公司通用型D N A 纯化回收试剂盒(U n i v e r s a l D N AP u r i f i -c a t i o nK i t)操作步骤纯化回收扩增产物㊂1.2.4 载体片段连接体系的构建A T 5G 47610基因的克隆以P E T32a 克隆载体进行㊂将载体P E T32a 进行B a m H1和S a c 1双酶切,与A T 5G 47610基因酶切片段进行连接㊂使用T4D N A 连接酶的连接体系(10μL )为:反应体系反应体积/μL10ˑB u f f e r1双酶切纯化A T 5G 47610基因片段2双酶切P E T32载体片段4T4D N A 连接酶1d d H 2O216ħ水浴过夜16h ㊂1.2.5 连接产物的转化1)自-80ħ中取出感受态细胞J M109,放置于冰上至完全溶解㊂2)取5μL AT 5G 47610基因片段与P E T32a 的连接产物与50μL 感受态细胞混匀,冰浴30m i n ㊂ 3)42ħ热冲击45s ,冰浴静置5m i n㊂ 4)加入800μLLB ,37ħ缓慢振摇1h ㊂ 5)5000r ㊃m i n -1离心5m i n,吸去部分上清,余下50μL 上清悬浮菌体,涂布于含50μg ㊃m L -1A m p 的L B 固体平板上,37ħ倒置培养18h ㊂1.2.6 表达菌株的制备及目标蛋白的诱导表达与检测挑选边缘光滑,大小均一的单菌落为模板进行菌落P C R ,找到阳性菌落㊂将菌落P C R 阳性单菌落保存并扩大培养,送上海I n v i t r o g e n 生物工程公司进行序列测定,收到测序结果后,与在N C B I 上查询的原始序列对比,进一步确定阳性结果的真实性㊂提取重组质粒,然后转化感受态细胞B L21㊂低温摇床诱导表达目标蛋白[14],并进行S D S -P a ge 蛋白表达检测㊂2 结果与分析2.1 拟南芥R N A 的提取R N A 的质量直接影响后续实验,由图1的电泳结果可以看到,一个泳道共出现了3条条带:28S ㊁18S ㊁5S ㊂3条条带很清晰,没有拖带,说明R N A 基本没有降解,提取质量良好,R N A 可用于后续实验㊂㊃28㊃问题探讨 陈 存等:拟南芥中一个锌指蛋白A T5g 47610的基因克隆及表达分析图1 拟南芥总R N A 提取凝胶电泳图2.2 目标基因A T 5G 47610的P C R 扩增以拟南芥c D N A 为模板,用已设计好的带有酶切位点(B a m H1和S a c 1)的目的基因的引物进行P C R扩增,并胶回收结果如图2,可以看到在M a r k e r560b p 位置有明亮的目标条带,通过灰度值计算其浓度进行下一步的实验㊂图2 A T 5G 47610基因胶回收后的电泳结果2.3 载体片段连接体系检测如图3所示,a ㊁b 泳道为B a m H1和S a c 1双酶切后产物,b 泳道双酶切获得的2条条带说明A T 5G 47610基因已成功连接到克隆载体P E T 32a 中㊂图3 载体片段连接体系酶切结果2.4 目标基因蛋白的诱导表达表达菌株经I P T G 诱导蛋白表达,收集菌体制样后,S D S -P A G E 电泳结果如图4㊂对比未添加I P T G的实验组,可以看到添加I P T G 的实验组在40K D 蛋白M a r k e r 处均有蛋白的表达,但由于I P T G 添加比例不同,目标蛋白亮度不一致㊂0.2mMI P T G 是最为合适的诱导浓度㊂注:a 泳道无I P T G ;b 泳道0.4mMI P T G ;c 泳道0.3mMI P T G ;d 泳道0.2mMI P T G ;e 泳道0.1mMI P T G ;f 泳道0.05mMI P T G ㊂图4 A T5g 47610蛋白表达S D S -P A G E 结果3 讨 论本课题组在前期研究发现了一个具有锌指结构的A T5g 47610蛋白,而它的同源蛋白A T2g 02960(A T P R F 1)经体外泛素化实验验证,为一个E3连接酶[15],另2个同源蛋白A T5g 43200(A t HH R2)[16]㊃38㊃种 子 (S e e d )第38卷 第4期 2019年4月V o l .38 N o .4 A pr . 2019和A T5g 43420(A T L16)[17]也被证实具有E3连接酶的功能㊂因此猜测同样具有锌指结构的A T5g 47610蛋白也同样具有E3连接酶的功能㊂为此,本研究进行了A T 5G 47610目的基因的克隆和表达载体的构建,并成功诱导了目标蛋白的表达,为后续鉴定A T5g 47610蛋白的E 3连接酶活性与奠定基础㊂E 3连接酶是一种与抗逆相关的泛素连接酶㊂根据结构与功能机制,E 3连接酶家族主要有三大类[18]:H E C T 家族,U -b o x 蛋白家族和R I N G -f i n ge r (锌指)家族㊂其中R I N G -f i ng e r 家族的E3连接酶发现较晚,但其种类庞大且功能复杂,成为近年来研究的热点㊂R yu 等在筛选拟南芥A B A 不敏感突变体的过程中鉴定出A t A I R P 1,它能够编码一个锌指类型泛素E 3连接酶[19]㊂D i n g 等发现,拟南芥里面一个锌指蛋白C H Y R 1,具有E 3连接酶的活性,能够提高植物的耐旱性,而其活性是通过被蛋白激酶S n R K2.6磷酸化来调控的[20]㊂P a r k 等从延迟萌发的水稻T -D N A 突变体中鉴定出一个R I N G -f i n g e r 类型泛素E3连接酶O s D S G 1,发现与野生型相比,o s d s g1突变体对干旱的耐受性增强,一系列A B A 信号通路相关及响应的基因和都能够在突变体中被诱导表达,说明O s D S G1是依赖于A B A 信号转导的干旱胁迫响应的负调节子[21]㊂ 筛选与鉴定拟南芥中同抗逆境相关的E3连接酶,分析其抗逆机制,再通过基因工程的手段,将相关的E3连接酶基因导入到其他农作物当中,将有助于获得抗逆的新品种,从而实现传统育种模式的新改革㊂参考文献:[1]Z o uX ,Z h a i P ,Z h a n g Q.V a r i a t i o n s i nd r o u g h t so v e rC h i n a :1951-2003[J ].G e o p h y s i c a lR e s e a r c h L e t t e r s ,2005,32(4):353-368.[2]B o y e rJS .P l a n t p r o d u c t i v i t y a n de n v i r o n m e n t [J ].S c i e n c e ,1982,218(4571):443-448.[3]Z i p f e l C .P a t t e r n -r e c o g n i t i o nr e c e p t o r s i n p l a n t i n n a t e i m m u n i t y [J ].C u r r e n tO p i n i o n i n I m m u n o l o g y ,2008,20(1):10-16.[4]L o d h a T D ,B a s a k J .P l a n t -p a t h o ge n i n t e r a c t i o n s :w h a t m i c r o a r r a y t e l l sa b o u ti t ?[J ].M o l e c u l a rB i o t e c h n o l o g y,2012,50(1):87-97.[5]H u a n g G T ,M aSL ,B a i LP ,e t a l .S i g n a l t r a n s d u c t i o nd u r -i n g c o l d ,s a l t ,a n dd r o u gh ts t r e s s e s i n p l a n t s [J ].M o l e c u l a r B i o l o g y R e po r t s 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