藤黄中藤黄酸B的制备分离方法优选及结构确证

Ｗｅｂｓｉｔｅ　ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ａｈｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ　安徽中医药大学学报第３４卷第１期２０１５年２月　Ｅ—ｍａｉｌ　ａｈｘｂｂｊｂ＠１６３．ｔｏｍ　

Ｊ　ＡＮＨＵＩ　ＵＮＩＶ　ＣＨＩＮＥＳＥ　ＭＥＤ　Ｖｏ１．３４　Ｎｏ．１　Ｆ＿ｅｂ．２０１５　

藤黄中藤黄酸Ｂ的制备分离方法优选及结构确证　贾步云　，彭代银　，李珊珊　，胡雪瑞　，朱光宇　，陈卫东　（１．安徽中医药大学药学院，安徽合肥２３００１２；２．安徽省马鞍山市中心医院，安徽马鞍山　２４３０００）　［摘要］目的　建立一种高效且重现性好的藤黄酸Ｂ的制备分离方法，并对分离产物进行结构确证。方法　采用　乙醇超声提取方式对藤黄药材进行初步提取，用中压制备色谱和高压制备色谱相结合的方式对藤黄乙醇提　取物中藤黄酸Ｂ进行分离和纯化，并采用正交设计对提取和分离工艺进行优化。采用红外光谱、质谱、　Ｈ一　核磁共振谱、¨Ｃ一核磁共振谱对分离得到的样品进行结构鉴定。结果　优选的分离方法较其他方法简便且　高效可控，分离得到的样品通过结构鉴定，确定为藤黄酸Ｂ且纯度可达到９９　以上。结论　所建立的藤黄　酸Ｂ的提取分离方法具有高效、简便且重现性好的特点。同时，本研究提供了藤黄酸Ｂ相对完整的谱图信　息，并确证了所分离藤黄酸Ｂ的结构。　［关键词］藤黄；藤黄酸；有效成分分离；结构确证　［中图分类号－ＩＲ２８４　ＥＤＯＩ］ｌＯ．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５—７２４６．２０１５．０１．０２４　

中药藤黄是藤黄科植物藤黄（Ｇａｒｃｉｎｉａ　ｈａｎ—　ｂｕｒｙｉ　Ｈｏｏｋ．ｆ）的干燥树脂，具有攻毒蚀疮、破血散　结、止血、杀虫的功效＿】］，临床上用于治疗痈疽肿毒、　顽癣恶疮、创伤出血及烫伤　］。现代研究发现藤黄　中具有多种抗癌有效成分，而目前的研究热点主要　集中在藤黄酸（ｇａｍｂｏｇｉｃ　ａｃｉｄ，ＧＡ）和新藤黄酸　（ｇａｍｂｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ，ＧＮＡ）这两种化合物。通过查阅　相关文献，发现藤黄酸Ｂ（ｍｏｒｅｌｌｉｃ　ａｃｉｄ，ＭＡ）也具有　较强的抗癌活性，ＭＡ对于人白血病Ｋ５６５２及　Ｋ５６２／ｓ细胞株有很好的抑制作用　；同时，ＭＡ也　具有一定的抗菌活性＿４］。目前对于ＭＡ分离纯化　的相关研究较少，且步骤相对较为繁琐＿３　］。本研究　采用中压制备液相色谱以及高压制备色谱从藤黄的　乙醇提取物中分离纯化得到ＭＡ，优选出一种简便　且重现性好的高纯度ＭＡ的提取分离方法，并对分　离得到的ＭＡ样品进行结构确证，为ＭＡ的进一步　研究奠定基础。　１仪器与材料　１．１　仪器　中压制备液相色谱：包括ＴＡＵＴＯ－　Ｇｒａｄ２００型中压二元梯度泵ＴＡＵＴＯＴＢＤ２０００型紫　外检测器：上海同田生物技术有限公司；中高压玻璃　制备色谱塔３１０　ｍｍＸ　１００　ｍｍ，填料ＯＤＳ　Ｃ１８　３Ｏ～５０　ｍ：苏州汇通色谱分离纯化有限公司；Ｎ２０００色谱工　作站：浙江大学智达信息工程有限公司；ｗａｔｅｒｓ　２５４５高压制备色谱系统：美国Ｗａｔｅｒｓ公司；ＡＢ　ＳＣＩＥＸ　ＱＴＲＡＰ　４５００系统：美国ＡＢ公司；超导　基金项目：国家科技部重大新药创制专项（２００９ＺＸ０９１０３—３９９）　作者简介：贾步云（１９８９一），男，硕士研究生　通信作者：陈卫东，ａｎｚｈｏｎｇｄｏｎｇ＠１２６．ｃｏｍ　傅立叶数字化核磁共振谱仪：瑞士布鲁克公司；岛津　ＬＣ一１５Ｃ高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计、红　外光谱仪：日本岛津公司；ＲＥ一２０００Ｂ型旋转蒸发　器：上海亚荣生化仪器厂；ＡＢ１２５一Ｓ型十万分之一分　析天平：德国梅特勒公司。　１．２材料　甲醇（分析纯）：安徽省安庆时联特种溶　剂股份有限公司；甲醇（色谱纯）：上海星可高纯溶剂　有限公司；甲酸、无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚：　均为分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司；藤　黄：批号２０１１０３—１，购自安徽亳州药材市场，经安徽　中医药大学王效山教授鉴定，为藤黄科植物藤黄　（Ｇａｒｃｉｎｉａ　ｈａｎｂｕｒｙｉ　Ｈｏｏｋ．ｆ．）的干燥树脂；ＭＡ对　照品由安徽中医药大学科研实验中心提供，纯度≥　９８％。　２　ＭＡ分析方法的建立　２．１色谱条件　岛津ＬＣ－１５Ｃ高效液相色谱仪（包　括ＬＣ－１５Ｃ高压输液泵、ＳＰＤ－１５Ｃ紫外检测器）；色谱　柱：ＣＯＳＭＯＳＩＬ　Ｃ１８柱（４．６　ｍｍ×２５０　ｍｍ，５　ｍ）；流动　相：甲醇：水（９０：１０）；柱温：３Ｏ。Ｃ；进样量２０／ａＬ；流速：　１．０　ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长：３６０　ｎｍ。ＭＡ色谱图见图１。　

６０　＞４Ｏ　ｇ　２０　

ｏ　Ｏ　时Ｉ司／ｍｉ“　

图１　ＭＡ高效液相色谱图　２．２　对照品溶液的配制　精密称取ＭＡ对照品　１０．０　ｍｇ，置于５Ｏ　ｍＬ容量瓶中，加甲醇定容至刻度　线，即得２００　ｇ／ｍＬ的对照品溶液，于４℃冰箱保存。　２．３供试品溶液的配制　精密称取ＭＡ样品１０．０　７８　Ｗｅｂｓｉｔｅ　ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ａｈｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ　安徽中医药大学学报第３４卷第１期２０１５年２月　Ｅ—ｍａｉｌ　ａｈｘｂｂｊｂ＠１６３．ｃｏｍ　

ｊ　ＡＮＨＵＩＵＮＩＶＣＨＩＮＥＳＥＭＥＤ　Ｖｏ１．３４　Ｎｏ．１　Ｆｅｂ．２０１５　

ｍｇ，置于５Ｏ　ｍＩ　容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，即　得２００“ｇ／ｍＩ　的对照品溶液，于４℃冰箱保存。　２．４线性关系考察　精密移取０．０２５、０．２５、０．５、　１、１．５、２、４、８　ｍＩ　的对照品溶液，置于５Ｏ　ｍＬ容量　瓶巾，加甲醇定容至刻度，配制成０．１、１、２、４、６、８、　ｌ６、３２址ｇ／／ｍＩ　的标准系列浓度，摇匀及过滤后，进样　分析，以峰面积（　）对ＭＡ的质量浓度（ｚ）进行线性回　归，回归方程：ｖ一３２　０８０ａ一５８９．３４（７．一０．９９９　８），表　明ＭＡ在０．１～３２　Ｆｇ／ｍＩ　浓度范围内线性良好。　２．５稳定性试验取供试品溶液分别于０、０．５、１、　２、３、４、５　ｈ进样分析，结果ＭＡ峰面积的ＲＳＤ为　１．２２　，表明ＭＡ的供试品溶液在５　ｈ内稳定。　２．６精密度试验取标准品溶液２００￣ｇ／ｍＬ，重复　进样５次，测定ＭＡ峰面积，计算ＭＡ峰面积的　ＲＳＤ值为０．７１　。　２．７　重复性试验　平行制备６份ＭＡ供试品溶　液，进样分析，计算ＭＡ峰面积ＲＳＤ值为１．４８　。　２．８　加样回收率试验　制备质量浓度分别为２０、　５０、１００“ｇ／ｍＩ　的供试品溶液各３份（共９份），每组　分别按供试品量的８０　、１００　、１２０　精密加入对　照品溶液，用流动相配成合适浓度，进样分析，计算　得平均加样回收率为９９．７４　，ＲＳＤ为１．０４　。　３分离与纯化　３．１藤黄总酸的提取　３．１．１提取方法取藤黄１００　ｇ，粉碎后用乙醇超　声提取，提取后静置３０　ｍｉｎ，待溶液分层后，取上层　液进行抽滤。取滤液在５Ｏ℃条件下减压蒸馏至浓　稠状，取Ｈｊ黏稠的液体倒入蒸发皿内，在５５　Ｃ下真　空干燥５～６　ｈ，待完全膨胀疏松后，取出产物进行　称量，即得藤黄总酸。　３．１．２　提取方法优化　采用正交设计对于ＭＡ的　巾压制备色谱分离方法进行优选，通过预实验选取　了乙醇浓度（Ａ）、乙醇用量（Ｂ）、提取时间（Ｃ）、提取　次数（Ｄ）为考察因素，以ＭＡ的得率为考察指标，因　素水平表如表１所示。　表１　正交试验因素水平表　３．１．３优化结果与分析在平行操作条件下，对按　照Ｌ。（３　）正交试验提取的９份十浸膏处理后分别　进样，测定ＭＡ的含量。正交试验结果及方差分析　见表２、表３。根据表２直观分析极差大小可知，影　响ＭＡ提取　素的主次顺序为：Ａ＞Ｄ＞Ｂ＞Ｃ；从方　差分析可见，Ａ因素的主效应有统计学意义。综合　考虑二者，藤黄总酸提取的最佳工艺条件为：　Ａ　Ｂ。Ｃ。Ｄ。，即提取工艺为９５　乙醇，６倍量，每次提　取３　ｈ，提取３次。　表２正交试验结果　表３　（３　）正交试验的方差分析结果　注：Ｆｏ　ｏ５（２，２）一１９．００。　３．１．４醇提优化工艺验证试验按照优化后的工艺　进行试验，测得３批干浸膏中ＭＡ的平均含量为０．９９　ｇ，ＲＳＤ值为ｌ＿５　，表明该提取工艺稳定可行。　３．２　ＭＡ的中压液相色谱分离　３．２．１样品前处理称取一定量藤黄总酸粉末，加　入无水乙醇１０　ｍＬ，在４Ｏ℃条件下超声２Ｏ　ｍｉｎ后　呈黏稠状，备用。　３．２．２分离方法取下中高压玻璃制备色谱塔预　柱的上盖，将“２．２．１”项下所述试样倒入预柱的填料　中并搅拌均匀，在拌样硅胶顶端撒上防冲硅胶后拧　紧上盖，打开中压制备液相色谱。为防止流速过快　将样品冲散，应逐渐提高流动相流速。按照色谱工　作站上的色谱图（图２）接取保留时间１２５．４～１８５．７　ｍｉｎ的色谱峰所对应的洗脱液，５５℃减压蒸馏，待　溶液刚刚饱和时取下，在室温下放置２～３　ｄ自然结　晶，使用微孑Ｌ滤膜进行抽滤，得ＭＡ粗品。　

图２　ＭＡ中压液相色谱图　Ｗｅｂｓｉｔｅ　ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ａｈｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ　安徽中医药大学学报第３４卷第１期２０１５年２月　Ｅ—ｍａｉｌ　ａｈｘｂｂｊｂ＠１６３．ＣＯ１ＴＩ　

Ｊ　ＡＮＨＵＩ　ＵＮＩＶ　ＣＨＩＮＥＳＥ　ＩＶＩＥＤ　Ｖｏ１．３４　Ｎｏ．１　Ｆｅｂ．２０１５　

３．２．３分离工艺优选　采用正交设计对于ＭＡ的　中压制备色谱分离方法进行优选，选取上样量（Ａ）、　流动相比例（Ｂ）以及流速（Ｃ）为考察因素，以ＭＡ的　得率为考察指标，因素水平表见表４。　表４正交试验因素水平表　

注：Ｆ。。５（２，２）一１９．００。　３．２．５　中压制备色谱分离优化工艺验证实验　按　照优化后的工艺进行实验，测得３批分离所得ＭＡ　粗品的平均得率为８Ｏ．８９　，ＲＳＤ值为１．６　，表明　该分离工艺稳定可行。　３．３　ＭＡ的高压制备色谱纯化　３．３．１　样品处理　取ＭＡ粗品１　ｇ逐渐加入甲醇　溶解成饱和溶液后，用０．４５　ｆｆｍ滤膜过滤，备用。　３．３．２分离纯化取“２．３．１”项下样品，通过ｗａ—　ｔｅｒｓ　２５４５高压制备色谱系统进行纯化，色谱条件为　色谱柱：ＳｕｎＦｉｒｅ　ｐｒｅｐ　ＣＩ８（３２　ｍｍＸ　２５０　ｍｍ，５　ｆｆｍ）；流　动相：甲醇：水（ｖ／ｖ）９０：１０；流速：１５　ｍＬ／ｒａｉｎ；进样　量：１　ｍＬ；检测波长：３６０　ｎｍ；洗脱液自动接收程序：按　照最小接收峰面积１５０　０００接收洗脱液；收集保留时　间为３３．００￣３４．００　ｍｉｎ洗脱液，并蒸干溶剂，即得纯　化后的ＭＡ样品。见图３。　３　２　《１　０　０．Ｕ　ｌＵ．Ｕ　２０．Ｕ　３０．０　４０．０　５０．０　时间／ｍｉｎ　图３　ＭＡ高压制备色谱图　３．４理化性质及鉴别　分离得到的ＭＡ为橙黄色　粉末，熔点温度为１０８～１０９℃。分别采用氯仿一甲　醇、石油醚一乙酸乙酯及石油醚一丙酮３种不同的展　开剂体系进行薄层鉴别，均为单一斑点。本研究采　用高效液相色谱法面积归一化法计算分离得到产物　的纯度，结果表明纯度大于９９　，符合结构鉴定的　要求。　３．５工艺流程图见图４。　ｌ　３　ｈ　滤液Ｉ　滤液ｌ　Ｉ减肽干燥　藤黄总酸Ｉ　图４　ＭＡ提取分离纯化工艺流程图　４　ＭＡ的结构确证　４．１　质谱取５／２ｇ／ｍＩ　的ＭＡ样品，于质谱中分　析，样品的电喷雾质谱图给出其准分子离子峰ｍ／ｚ　为５６１．１（Ｍ　），其分子量约为５６１。同时，图谱也给　出了其主要碎片峰，分别为：５０５．０（Ｃ２。Ｈ　。０８），４７７．１　（Ｃ２８　Ｈ２９　Ｏ７），４５９．０（Ｃ２８　Ｈ２７　Ｏ６），４４１．０（Ｃ２８　Ｈ２５　Ｏ５），　４１８．９（Ｃ２６　Ｈ２７　），３７８．８（Ｃ２３　Ｈ２３　），３３７．８（Ｃ　。Ｈ】　０６），　２２９．１（Ｃ１。Ｈ。Ｏ４）。将上述质谱数据与文献［６］中ＭＡ　的电喷雾质谱数据进行比对，数据一致。　４．２红外光谱　ＭＡ样品的红外光谱图中３　０８０　ｃｍ　处强吸收峰为酚羟基伸缩振动。２　９７６、２　９２８