抗氧化剂PDTC对肝癌细胞株Hep3B增殖的影响及机制

山东医药２０１０年第５Ｏ卷第７期　

抗氧化剂ＰＤＴＣ对肝癌细胞株Ｈｅｐ３Ｂ　

增殖的影响及机制　

焦建新。季万胜，高志星，张红梅。李蕾，原皓，冯玉光。张小茜　

（潍坊医学院附属医院，山东潍坊２６１０３１）　

摘要：目的探讨抗氧化剂二硫代氨基甲酸毗咯烷（ＰＤＴＣ）在肝细胞性肝癌化学预防中的作用及机制。方法　将不同浓度ＰＤＴＣ、阿霉素及ＰＤＴＣ联用阿霉素作用于Ｈｅｐ３Ｂ细胞。采用ⅣｒＩ］ｒ法检测细胞存活率；流式细胞术　（ＦＣＭ）检测凋亡率；电泳迁移率变动分析（ＥＭＳＡ）检测ＮＦ—ＫＢ活性。结果ＰＤＴＣ作用后Ｈｅｐ３Ｂ存活率明显降低，　呈浓度依赖性，Ｐ＜０．０１。阿霉素联用ＰＤＴＣ的细胞生长抑制率明显高于单用阿霉素（Ｐ＜０．０１）。ＰＤＴＣ为１０　ｍｏＬ／Ｌ时的细胞凋亡率明显低于５０　Ｖ．ｍｏｌ／Ｌ时（Ｐ＜０．０１）。ＥＭＳＡ示ＰＤＴＣ作用后ＮＦ－ＫＢ表达降低，不同浓度　ＰＤＴＣ作用两两相比Ｐ＜０．Ｏｌ。结论ＰＤＴＣ能抑制肝癌细胞株Ｈｅｐ３Ｂ的增殖、促进细胞凋亡、增强阿霉素的细胞　毒作用；其作用机制主要是抑制ＮＦ．ＫＢ激活。ＰＤＴＣ可用于肝癌的化学预防，联用阿霉素可进一步提高疗效。　关键词：核因子；细胞凋亡，肝肿瘤；二硫代氨基甲酸吡咯烷　中图分类号：Ｒ７３５．７　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１０）０７－０００９－０３　

Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ＰＤＴＣ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　Ｈｅｐ３Ｂ　

ｃｅｌｌｓ　ｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　

０　Ｊｉａｎ—ｘｉｎ，ＪＩ　一ｓｈｅｎｇ，ＧＡＯ　一ｘｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｈｏｎｇ—ｍｅｉ，ＬＩ　Ｌｅｉ，ＹＵＡＮ　Ｈａｏ，　

ＦＥＮＧ　Ｙｕ－ｇｕａｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ—ｑｉａｎ　

（Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　扣增Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，耽扣　２６１０３１，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ　ｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ（ＰＤＴＣ）　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＣＣ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｅｙｔｏｔｏｘｉｔｙ　ｏｆ　ＰＤＴＣ，ａｄｒｉａｍｙｅｉｎ，ｏｒ　ＰＤＴＣ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ　ｔｏ　Ｈｅｐ３Ｂ　ｃｅｉｌｓ　ｌｉｎｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ．Ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＦＣＭ．Ｔｈｅ　ＮＦ—　

ｋａｐｐａ　Ｂ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　Ｈｅｐ３Ｂ　ｃｅｌｌｓ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　Ｈｅｐ３Ｂ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ＰＤＴＣ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＥＭＳＡ．Ｒｅｓｄ￣ＰＤＴＣ　ｉｎｈｉｂｉ－　ｔｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｐ３Ｂ　ｃｅｌｌｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｉｎ　

ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ＰＤＴＣ　ｇｒｏｕｐ　Ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ　ａｌｏｎｅ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．Ｏ１）．Ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｔｉｅ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｉｎ　１０　ｍｏＬ／Ｌ　ＰＤＴＣ　ｇｒｏｕｐ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　５０　ＩＪ．ｍｏｌ／Ｌ　ＰＤＴＣ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．ＰＤＴＣ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＮＦ—ＫＢ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　ＰＤＴＣ　ｅ８／１　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｐ３Ｂ　ｃｅｌｌｓ，ｐｒｏｍｏｔｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ａｄｒｉａｍｙｅｉｎ．Ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｉｓ　ｍａｉｎｌｙ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＮＦ—ＫＢ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ＰＤＴＣ　ｍｉｉｇｈｔ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＣＣ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｃａｎ　ｂｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｗｈｅｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｄｒｉａｍｙｅｉｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ｋａｐｐａ　Ｂ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ，ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ　ｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ　

应用化学预防剂阻止癌症发生是目前新的防癌　

策略…。化学预防是调节靶器官内致癌物代谢活　

化和对ＤＮＡ攻击的能力，或作用于促癌阶段如增强　

机体修复与免疫功能等从而阻断肿瘤细胞增殖的一　

种方法，抗氧化剂是化学预防剂中重要的一类。　

２００８年９月一２００９年６月，我们观察了新一代抗氧　

化剂二硫代氨基甲酸吡咯烷（ＰＤＴＣ）对肝癌细胞株　

Ｈｅｐ３Ｂ增殖、凋亡及ＮＦ．ＫＢ活性的影响，探讨其用　

基金项目：潍坊市科学技术局资助项目（２００８年第７９号）。　于肝癌化学预防的可行性及机制。　

１材料与方法　

１．１材料肝癌细胞株Ｈｅｐ３Ｂ购自中国科学院上　

海细胞生物学研究所。小牛血清购自杭州四季青生　

物工程材料有限公司。ＭＴｒ购自美国Ｓｉｇｍａ公司。　

ＰＤＴＣ购自北京舒伯伟化工仪器有限责任公司。　

ＰＣＲ试剂为Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ公司产品，ＮＦ—ＫＢ的寡核　

苷酸探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合　

成。　

１．２细胞培养将Ｈｅｐ３Ｂ细胞置于含１０％小牛血　

９　清的ＲＰＭＩ１６４０培养基中于，３７　ｏＣ、５％ＣＯ　、９５％湿　

度的培养箱内培养，以２．５　ｇ／Ｌ胰蛋白酶消化传代，　

２—３　ｄ传代１次。　

１．３　ＰＤＴＣ干预及细胞生长抑制率检测　取对数　

生长期Ｈｅｐ３Ｂ细胞制成单细胞悬液，置９６孔培养　

板并分为五组。ＰＤＴＣ组分别加入１、５、１０、５０、１００　

Ｉｘｍｏ［／Ｌ的ＰＤＴＣ；阿霉素组分别加人０．１、１、１０、１００　

ｇ／ＩＹＩｌ的阿霉素；联合组加入１０　ｉｘｍｏＬ／Ｌ　ＰＤＴＣ预作　

用后再分别加Ｏ．１、ｌ、１０、１００　ｎｇ／ｍｌ的阿霉素；对照　

组单加Ｈｅｐ３Ｂ细胞；空白对照组单加培养液。各组　

培养４８　ｈ后，每孔加５　ｍｇ／ｍｌ的Ｍ１Ｔｒ　ｌ０　Ｉｘｌ，４　ｈ后　

吸净上清液加１００　ＶＩ　ＤＭＳＯ终止反应，用酶标仪于　

４９０　ｎｍ波长处测定吸光度值（Ａ值）。细胞存活率　

＝（实验组Ａ值一空白对照组Ａ值）／（对照组Ａ值　

一空白对照组Ａ值）ｘ　１００％，细胞生长抑制率＝１　

一细胞存活率。　

１．４　ＰＤＴＣ干预及细胞凋亡率检测　将对数生长　

期细胞分为两组。观察组分别加入１０、５０　Ｉｘｍｏ￣Ｌ　

的ＰＤＴＣ；对照组单加Ｈｅｐ３Ｂ细胞。作用２４　ｈ，收集　

细胞，制备单细胞悬液，ＰＢＳ漂洗，ＰＩ染色，ＦＣＭ测　定细胞凋亡率。　

１．５　ＰＤＴＣ干预及细胞ＮＦ．ＫＢ活性检测　

１．５．１分组及干预将对数生长期细胞分为两组，　

对照组不加ＰＤＴＣ；ＰＤＴＣ组分别加入５、１０、５Ｏ　

Ｉｘｍｏｌ／Ｌ的ＰＤＴＣ。作用４　ｈ后收集细胞，ＰＢＳ洗涤，　１　０００　ｒｐｍ离心３　ｍｉｎ。沉淀用缓冲液Ａ悬浮，置冰　

上加２．５　ｔｘｌ　ＮＰ－４０，振荡１０　ｓ。６　５００　ｒｐｍ离心２　

ｒａｉｎ，弃上清，沉淀加缓冲液Ｂ悬浮。１２　０００　ｒｐｍ离　

心１０　ｍｉｎ，上清液中即含核蛋白。按上海申能博彩　

生物科技有限公司的ＢＣＡ一１００蛋白质定量测定试　

剂盒说明测定核蛋白浓度。　

Ｉ．５．２探针标记ＮＦ—ＫＢ探针上游引物：５　一ＡＧＴＴ—　

ＧＡＧＧＧＧＡＣ唧ＣＣＡＧＧＣ一３　，下游引物５　．ＧＣＣＴ．　

ＧＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴ－３　。以ＴＥＮ缓冲液分别　

溶解寡核苷酸单链。等摩尔比混合两条单链，９５℃　

１０　ｒａｉｎ，冷却至室温，ＴＥＮ缓冲液稀释。冰上与ｌａ—　

ｂｅｌｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ、ＣｏＣ１２、ＤＩＧ—Ｉ　１一ｄｄＵＴＰ、Ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ—　ａｓｅ混匀，离心。３７℃１５　ｒａｉｎ，置冰上加２　ｌ　ＥＤＴＡ　

终止反应。加３　ＩＸｌ　ｄｄＨ　０，使标记探针终浓度为　

０．１５５　ｐｍｏｌ／ｉｘｌ。　

１．５．３核蛋白结合反应标记探针加入６管：①　

管：无核蛋白；②管：核蛋白及１２５倍过量的未标记　

探针；③管：核蛋白；④管：核蛋白５　ｉｘｍｏｌ／Ｌ　ＰＤＴＣ作　

用４　ｈ；⑤管：核蛋白１０　Ｉｘｍｏ￣Ｌ　ＰＤＴＣ作用４　ｈ；⑥　

管：核蛋白５０　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ　ＰＤＴＣ作用４　ｈ。各加入５　ｘ　

１Ｏ　山东医药２０１０年第５０卷第７期　

Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ、ｐｏｌｙ　ｄＩ—Ｃ、ｐｏｌｙ　Ｌ—ｌｙｓｉｎｅ、ｄｄＨ２Ｏ、未标　

记探针，室温反应２０　ｒａｉｎ，置冰上加５　上样缓冲　

液，上样于聚丙烯酰胺凝胶中电泳１．５　ｈ。　

１．５．４转移电泳凝胶一侧覆盖预先浸泡阳离子　

的尼龙膜和４层Ｗｈａｔｍａｎ　３　ｍｍ滤纸，另一侧覆盖４　

层滤纸，放转移电泳装置中电泳３０　ｍｉｎ。　

１．５．５　化学发光检测　尼龙膜置１２０　ｏＣ烤膜３Ｏ　

ｍｉｎ，Ｗａｓｈｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ液洗膜。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ａｎｔｉ—　

ｂｏｄｙ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ各孵育膜３０　ｍｉｎ，洗膜２次。Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　

ｂｕｆｆｅｒ平衡膜５　ｒａｉｎ。尼龙膜置两层塑料膜之间，用　

ＣＳＰＤ涂匀尼龙膜。室温反应５　ｒａｉｎ，３７℃加强反应　

１０　ｍｉｎ。将ｘ线胶片压在尼龙膜上，曝光２０　ｒａｉｎ。　

显影及定影Ｘ线胶片。　

１．５．６图像分析用柯达数码科学识别影像分析　

软件测定活性条带的净灰度值（ＮＩ），定量分析ＮＦ—　

ＫＢ表达量。　

１．６　统计学方法　检测结果以　±ｓ表示，采用　

ＳＰＳＳ　１１．０软件进行方差分析，多组间比较采用　

ＳＮＫ　ｑ检验；两组问比较采用ｔ检验。Ｐ≤０．０５为差　

异有统计学意义。　

２结果　

２．１　细胞存活率ＰＤＴＣ组１、５、１Ｏ、５Ｏ、　

１００　ＬＬｍｏｌ／，Ｌ的ＰＤＴＣ作用４８　ｈ后Ｈｅｐ３Ｂ细胞的存　

活率（％）分别为９６．１土１．９、８４．７±２．３、６９．３　４－　

２．６、４７．６±１．８、３４．８±２．２，细胞存活率随ＰＤＴＣ浓　

度增高而降低，差异均有统计学意义（ｑ：６．５７５～　

１２．０５４，Ｐ＜０．０１）。阿霉素组０、０．１、１、１０、１００　ｇ／　

ｍｌ的阿霉素作用４８　ｈ后分别为９８．２±Ｉ．８、９３．７±　

３．５、８７．３±５．４、７３．６±５．３、３６．７±２．３；联合组分　

另０为７０．３±４．２、６６．２±４．８、５８．６±３．７、４１．６±　

４．１、２１．４±２．１，联合组细胞存活率明显低于单用阿　

霉素组，差异均有统计学意义（　＝５．８８４～１０．５７６，Ｐ　

＜０．０１）。　

２．２细胞凋亡率ＦＣＭ结果呈现特征性的亚二倍　

体峰。观察组１０　Ｉｘｍｏ￣Ｌ的ＰＤＴＣ作用后凋亡率为　

１２．４％±２．７％；５０　ＩｘｍｏＶＬ作用后凋亡率达２５．７％　

±４．５％；对照组凋亡率为１．９％±０．８％，差异均有　

统计学意义（ｑ＝９．８６７～２２．３７５，Ｐ＜０．０１）。　

２．３细胞ＮＦ—ＫＢ活性①、②管样本仅有自由带　

无迟滞带，其他管样本均可见迟滞带，随ＰＤＴＣ浓度　

的增高，迟滞带灰度逐渐降低。对照管迟滞带灰度　

值为１５８　９７８±５２．８，而５、１Ｏ、５０　ＩｘｍｏＵＬ的ＰＤＴＣ　

作用后分别为１３８　７６９±４６．２、１０３　８９７±３２．６、６９　

７９６±２５．７，差异均有统计学意义（ｑ＝５１．１２６—　

８８．２０３，Ｐ＜０．０１），显示ＰＤＴＣ能浓度依赖性地抑制