04 实验四 酶的性质

1 实验四 酶的性质 【实验目的】 1.加深对酶的性质的认识。 2.掌握影响酶活力的各种因素及其原理。 一、酶的特异性 【实验原理】 酶的特异性是指酶对它所催化的反应以及底物结构有严格选择性，一种酶只对一种物质或一类结构相似的物质起作用。酶比一般催化剂特异性强，因酶是一种蛋白质，结构复杂，在其精细的空间构象中，存在一个特殊部分“活性部位”，能专一地与对应的底物结合，体现酶的特异性。 本实验以蛋白酶和淀粉酶对相应底物蛋白质及淀粉的作用为例。来观察酶的特异性，实验结果的检查根据酪蛋白水解生成酪氨酸，酪氨酸与福林试剂呈蓝色反应，淀粉能与碘起蓝色或兰紫色反映来确定。 【实验材料】 1. 实验器材 试管及试管架；移液管； 烧杯；恒温水浴锅； 温度计 2. 实验试剂 ⑴ 1% 淀粉溶液：将1g淀粉溶解于100ml蒸馏水中。 ⑵ 1%酪蛋白溶液: 称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入 0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟,溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。 ⑶ 1/2000碱性蛋白酶溶液: 精确称取干酶粉2克，加入pH10硼砂氢氧化钠缓冲溶液10ml，在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静止片刻后，将上层液小心倾入容量瓶中，残渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶解4次，最后全部移入200ml容量瓶中。用缓冲溶液定容至刻度，充分摇匀，用二层纱布或四层纱布过滤，吸取滤液5ml，移入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，所得液为稀释2000倍的酶液。 ⑷ pH10 硼砂氢氧化钠缓冲液： 甲液（0.05moL/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000ml 。 乙液：0.2moL/L氢氧化钠溶液。 配制pH10硼砂-氢氧化钠溶液：吸取甲液50ml，再加入乙液21ml，用蒸馏水定容至200ml。 ⑸ 0.4 mol/L碳酸钠溶液 (6) 0.4 mol/L三氯醋酸溶液 ⑺ 福林试剂: 在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2W04·2H20)、125g钼酸钠(Na2Mo04;2H20)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500ml，过滤，置于棕色瓶中暗处保存。使用前加4倍蒸馏水稀释。 ⑻ 1/2000淀粉酶溶液：用蒸馏水作稀释溶剂，配制方法同碱性蛋白酶液相同。 ⑼ 碘-碘化钾溶液: 称取碘10克，碘化钾20克，同溶于100m1蒸馏水中，贮于棕色瓶内。使用前稀释10倍。 【实验操作】 1.取五支试管, 编号，按下表加入试剂：

试剂 试管编号

对照 1 2 3 4 2

1% 酪蛋白溶液(ml) 1.0 1.0 1.0 pH10 缓冲液(ml) 1.0 蒸馏水 (ml) 2.0 1.0 1.0 1.0 1% 淀粉溶液(ml) 1.0 1.0 1/2000碱性蛋白酶溶液(ml) 1.0 1.0 1/2000淀粉酶溶液(ml) 1.0 1.0 2．将各管充分摇匀后，于40℃水浴中保温15分钟。 3．于3、4号管中各加碘溶液2滴，观察实验现象，做好记录。 4．于对照管及1、2号管各加入3.0mL 0.4M 三氯醋酸溶液，摇匀，分别过滤，各吸取滤液1.0ml，加0.4M碳酸钠溶液5.0ml，福林试剂1.0ml，摇匀，于40℃水浴保温15分钟。取出后观察三管的现象，并记录。 二、温度对酶活力的影响 【实验原理】 与大多数化学反应一样，温度对酶活性有显著影响。在一定的温度范围，酶的活性通常随着温度的升高而升高，因为有更多的分子成为活化分子。反之，下降。通常温度每升高10℃，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。另一方面，酶是一种蛋白质，温度提高可引起蛋白质变性，导致酶活性逐渐丧失。因此，每种酶都有它的最适温度，即酶促反应速度达最大值时的温度。如果反应温度超过最适温度，随着温度的升高，反应速度逐渐下降，以至完全停止反应。通常酶的最适温度接近于它所存在的生物体的温度，比如，人体中的大多数酶的最适温度是37℃左右。本实验以唾液淀粉酶在不同温度下对淀粉的作用为例，观察温度对酶活性的影响, 唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各种不同大小分子糊精及麦芽糖，它们遇碘各呈不同的颜色。从而判断淀粉酶是否存在及其酶活性大小。 【实验材料】 1. 实验器材 试管及试管架；漏斗；烧杯；恒温水浴锅；温度计 2. 实验试剂 ⑴ 1% 淀粉溶液：同酶特异性实验 ⑵ 碘-碘化钾溶液: 称取碘4克，碘化钾6克，同溶于100ml蒸馏水中，贮于棕色瓶内。 ⑶ 稀释的唾液 【实验操作】 1．漱口后收集唾液，用小漏斗加脱脂棉过滤，用蒸馏水稀释5～20倍(根据各人的酶活性而定)，混匀后备用。 2．取试管2支，各加稀释唾液2ml，一管直接加热煮沸，另一管置冰浴中预冷5分钟。 3．另取4支试管，编号序号，按下表添加试剂：

步骤 试管编号

1 2 3 4 第一步 加1%淀粉液20滴 加1%淀粉液20滴 加1%淀粉液20滴 加1%淀粉液20滴 第二步 置于冰浴5分钟 置于37℃水浴5分钟 第三步 加预冷的唾液10滴 加唾液10滴 加煮沸唾液10滴 第四步 摇匀置于冰浴10分钟 摇匀置于37℃水浴10分钟 3

第五步 移置37℃水浴10分钟 加碘液1滴 加碘液1滴 实验现象 三、pH对酶活力的影响 【实验原理】

酶活力受环境pH的影响，在一定pH下，酶表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力

降低，通常把表现出酶最大活力的pH称为该酶的最适pH。pH影响酶活力的主要原因有以下几个方面，首先，pH影响酶分子活性部位上有关基团的解离，另外，也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心与底物的结合或催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚至会使酶变性。尽管有一些酶能忍受较大的pH的变化，但大多数酶保持活性的pH值范围很窄。正因如此，生物体使用缓冲液调节体内的适宜pH值。 【实验材料】 1. 实验器材 试管及试管架；漏斗及滤纸；恒温水浴锅；温度计；移液管 2. 实验试剂 ⑴ 1% 酪蛋白溶液：同酶的特异性实验 ⑵ 1/2000碱性蛋白酶溶液：同酶的特异性实验 ⑶ pH10 硼砂氢氧化钠缓冲液: 同酶的特异性实验 ⑷ 0.1mol/L盐酸 ⑸ 0.2 mol/L 氢氧化钠溶液 ⑹ 0.4 mol/L碳酸钠溶液 ⑺ 0.4 mol/L三氯醋酸溶液 ⑻ 福林试剂: 同的酶特异性实验 【实验操作】 取三支试管, 按下表加入试剂：

试剂 试管编号

1 2 3 1% 酪蛋白溶液(ml) 1.0 1.0 1.0 pH10 缓冲液(ml) 1.0 — — 0.1M HCl(ml) — 1.0 — 0.2M NaOH 溶液(ml) — — 1.0 1/2000碱性蛋白酶溶液(ml) 1.0 1.0 1.0 实验现象 混合均匀后，于40℃水浴中保温15分钟。 然后每管各加入0.4M 三氯醋酸溶液3.0ml，分别过滤，各吸取滤液1.0ml，加0.4M碳酸钠溶液5.0ml，福林试剂1.0ml，摇匀，于40℃水浴保温15分钟，观察现象，比较在不同pH下，碱性蛋白酶活力的大小。 四、激动剂和抑制剂对酶活力的影响 【实验原理】 许多物质能影响酶的催化活性，能加速酶的催化作用的物质称为激动剂，能抑制酶的催化作用的物质称为抑制剂。本实验分别考察MnCl2和HgCl2对碱性蛋白酶的激动和抑制作用。 【实验材料】 1. 实验器材 4

试管及试管架；漏斗及滤纸；恒温水浴锅；温度计；移液管；721分光光度计 2. 实验试剂 ⑴ 1% 酪蛋白溶液：同酶特异性实验 ⑵ 1/2000碱性蛋白酶溶液：同酶特异性实验 ⑶ pH10 硼砂氢氧化钠缓冲液: 同酶特异性实验 ⑷ 8×10-3M MnCl2溶液 ⑸ 8×10-3M HgCl2溶液 (6) 0.4 mol/L碳酸钠溶液 ⑺ 0.4 mol/L三氯醋酸溶液 ⑻ 福林试剂: 同酶的特异性实验 【实验操作】 取三支试管, 按下表加入试剂： 试剂 试管编号 1 2 3 1% 酪蛋白溶液(ml) 1.0 1.0 1.0 pH10 缓冲液(ml) 1.0 1.0 1.0 8×10-3M MnCl2 溶液(ml) 1.0 ― ― 8×10-3M HgCl2 溶液(ml) ― 1.0 ― 蒸馏水(ml) ― ― 1.0 1/2000碱性蛋白酶溶液(ml) 1.0 1.0 1.0

实验结果 混合均匀后，于40℃水浴中保温15分钟. 然后每管各加入0.4M 三氯醋酸溶液3.0ml，分别过滤，各吸取滤液1.0ml，加0.4M碳酸钠溶液5.0ml，福林试剂1.0ml，摇匀，于40℃水浴保温15分钟。显色后用721型分光光度计，在波长680nm处测定光密度（比色时，以蒸馏水作空白）并记录。 【注意事项】 1．每个人的唾液淀粉酶活性并不相同，有时差别很大，因此稀释倍数可因个人情况而定。 2．少量的激动激或抑制剂就能影响酶的活性。但激动剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激动剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。对一种酶是激动剂，对另一种酶是抑制剂。 3．反应时间要准确，做酶学实验所用的器皿必需洁净、干燥，定量准确。 【思考题】 1．什么是酶的最适温度、最适pH值？有何实际意义？ 2．影响酶的催化活性的因素有哪些？简要说明作用原理。 3．酶学实验必须注意控制哪些条件？为什么？