定量PCR引物探针设计原则
- 格式:doc
- 大小:26.50 KB
- 文档页数:3
精心整理定量PCR引物、探针设计原则
自90年代Taqman探针诞生以来,虽然荧光探针(引物)不断有新的技术出现,但是作为一种经典的定量PCR技术,Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选,这主要是因为相对于SYBR荧光染料,Taqman探针具有序列特异性,只结合到互补区,而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系,因此特异性强灵敏度高,而且条件优化容易;而相对于杂交探针,Taqman探针只要设计一条探针,因此探针设计较便宜方便,而且也能完成基本的定量PCR要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针,也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为:目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→
的DNA
保持GC
典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。
Tm值在55-65℃(因为60℃核酸外切酶活性最高),GC含量在40%-60%
引物之间的TM相差避免超过2℃
引物的3’端避免使用碱基A,引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子。
Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp
引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。
探针设计原则
探针位置尽可能地靠近上游引物
探针长度应在15-45bp(最好是20-30bp),以保证结合特异性
检测探针的DNA折叠和二级结构
Tm值在65-70℃,通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃),GC含量在40%-70%
探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用,而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
Tm
交,
3’端2
bp,探变。
1000到5000
Taqman 探针,另外不同就是分步法的不同。其中需要注意的是:
扩增酶最好选用热启动酶
引物和探针的浓度需要进行优化,有人建议从50nM开始,在50nM—900nM之间优化,一般为200nM(注意探针需要避光保存。
同样Mg+和酶量也需要进行优化,酶的推荐反应浓度是1.25-1.5U(50ul)
DNA模板的添加量通常在100ng以下,因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时可进行梯度稀释,确定最佳的DNA模板添加量。如果欲进行2StepRT-PCR反应的第二步PCR 扩增反应,第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
另外循环参数虽然在引物和探针设计完之后也就确定了,但是有时也需要进行优化。
第七步:在进行数据分析的时候,通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线,然后
计算相对方程式。方程式的斜
度可以用来检查PCR的效率,对于100%PCR效率来说,一个理想的斜率是3.32。最佳的标准曲线是建立在PCR的扩增效率为90%-100%(100%意味着在每个循环之后,模板的总数将增加为前一次的2倍)的基础上。所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2≥0.99),这样才能认为实验的过程和数据是可信的。使用这个方程式我们可以计算出未知样本的初始模板量。大多数定量PCR仪都有这样一个软件,它可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
这其中有两种基本的方法:绝对定量和相对定量,研究人员需要根据自己的实验目的来选择。绝对定量是指将未知样品与标准曲线相比较进行分析,一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA 样品,要注意得是绝对定量分析的准确性是相对标准品的准确性而言的。相对定量是指两个或更多
另外还有,
1.
2.
越好。
3.
4.
反应5.