植物叶绿素荧光成像技术在国内的应用

植物叶绿素荧光成像技术在国内的应用（第四期）

植物叶绿素荧光成像技术作为最早实用化的叶绿素荧光成像技术，是目前世界上最权威、使用范围最广、种类最全面、发表论文最多的叶绿素荧光成像技术。涵盖了从叶绿体、单个细胞、微藻到叶片、果实、花朵，乃至整株植物和植物灌层，几乎可以测量所有的植物样品，甚至包括含有叶绿素的微生物和动物。

叶绿素荧光成像技术最早在21世纪初引进到国内，但一直到2010年后国内的科学家才在国际交流中逐渐发现这项技术的巨大价值，在短短数年中也利用这一技术发表了几十篇高水平SCI 文献。本期主要介绍目前叶绿素荧光成像技术在国内的应用情况。

一、 植物光合生理研究

叶绿素荧光可以直接反应植物光系统的生理状况，因此从叶绿素荧光技术发明之初，就被用于各种植物光合生理研究。

山东农科院使用FluorCam 叶绿素荧光成像技术研究了小麦旗叶与外露花梗光合能力的差异[1]。研究中发现在小麦生长前中期，旗叶与外露花梗的最大光化学效率Fv/Fm 和量子产额ΦPSII 基本相同。但在生长后期，旗叶的光合能力显著下降，而花梗光合能力的下降幅度要小于旗叶（图1）。这证明了在生长后期的灌浆期，花梗对维持籽粒的生长更为重要。

之后，他们又研究了小麦叶片和颖片季节衰老过程中以及颖果发育过程中光合特性的变化[2；3，图2]。

图2. 不同生长期小麦叶片和颖片的最大光化学效率Fv/Fm （A ）、量子产额ΦPSII （B ）和非光化学淬灭NPQ （C ）的变

化

图1. 不同生长阶段的旗叶（A ，C ）和外露花梗（B ，D ）的Fv/Fm （A ，B ）和ΦPSII （C ，D ）典型叶绿素荧光成像图

二、植物生物/非生物逆境胁迫与抗逆性研究

由于几乎所有种类的生物/非生物逆境胁迫都会影响到植物光合系统的正常生理功能，而叶绿素荧光技术是公认的植物逆境光合功能研究最灵敏的无损探针。因此通过叶绿素荧光成像技术不但能反映植物受胁迫程度和抗逆能力的差异，而且能指明胁迫影响光合系统的具体机理过程。

1.养分亏缺

山东农业大学使用研究了两种玉米在不同施氮条件下光合特性的变化[4]。研究发现，施加氮肥使两个品种的最大光化学效率Fv/Fm和量子产额ΦPSII都有所升高，而ΦPSII的升高幅度要高于Fv/Fm，表明氮肥对PSII的实际功能活性更有作用。同时玉米品种HZ4荧光参数的升高幅度也要高于Q319，这应该是由于HZ4是一种低N效率的非持绿玉米（图3）。

图3. 氮对两种玉米品种造成影响的叶绿素荧光成像图

2.盐碱胁迫

山东农业大学使用研究发现S-adenosyl-L-methionine (SAM)基因过表达会显著增加在碱胁迫下的番茄的光合能力[5]（图4）。

图4. 野生型和转基因番茄叶片在碱胁迫下的Fv/Fm荧光成像图

3.水分胁迫

山东农科院研究了不同灌溉方式对小麦光合特性的影响[6]。研究发现比起传统的漫灌，沟灌条件下的小麦叶片有更高的最大光化学效率Fv/Fm、量子产额ΦPSII、光化学淬灭qP和更低的非光化学淬灭NPQ（图5）。这说明沟灌给小麦提供了更好的土壤水分条件，从而使小麦叶片拥有了更强的光化学活性。

图5. 传统漫灌和沟灌条件下小麦的Fv/Fm、ΦPSII、qP和NPQ荧光成像图

国内还有其他院校使用开展了热胁迫、病害、重金属毒害、光质影响等多种胁迫研究[7；8；9；10]。

三、植物光合基因组学与分子生物学研究

植物光合作用可以说是植物对人类乃至整个生物圈最重要的功能，一方面为其他生物直接或间接地提供能量和食物，另一方面也在地球碳氧循环中发挥关键性作用。因此，对植物光合作用功能基因的研究，一直是植物基因组学与分子生物学研究的重中之重。而叶绿素荧光能直接反映相关功能基因的表型变化，所以几乎所有与光合基因相关的研究都要用叶绿素荧光技术来进行表型筛选、基因功能验证等方面的工作。

1. 从光合表型到基因功能

中国科学院植物研究所张立新研究员是最早将FluorCam 叶绿素荧光成像技术引入国内的科学家。中科院植物所光生物学重点实验室是国内植物光合基因相关研究最前沿的科研单位。FluorCam 叶绿素荧光成像技术引入后就立刻用于了光合相关基因功能与表型研究。

2006年，张立新研究团队就使用FluorCam 叶绿素荧光成像技术研究了拟南芥ppt1突变体光系统II 光化学能力的变化，进而证明了磷酸盐转运蛋白对维持叶片生长后期正常光合作用的重要性[11]（图6）。

之后，植物所张立新团队和彭连伟团队都使用FluorCam 发表了多篇植物光合基因相关文献[12；13]。

彭连伟在研究NADH 脱氢酶复合体稳定性时[14]，发现在50µmol photons /m².s 的光强下，lhca5 lhca6 pgr5、lhca6 pgr5和crr4-2 pgr5拟南

芥突变体都产生了生长阻滞，并表现出了高叶绿素荧光（图7A ，B ）。这表明了这些突变体的光合电子传递活性和NDH 活性都受到了抑制。进一步分析不同光强下的ΦPSII ，野生型、lhca5和lhca6突变体的ΦPSII 水平是相近的，这表明Lhca5和Lhca6在光合电子传递中都不是必需的（图7C ）。而lhca6 pgr5和lhca5 lhca6 pgr5的ΦPSII 水平则显著降低，通过其他结果比对发现这是由于在低光照条件下，这些突变体的PSI 就受到了光抑制并出现了氧化应激反应。

在后续的研究中，彭连伟团队还使用FluorCam 发现了NdhV 亚基对NADH 脱氢酶复合体稳定性的重要作用[15]。其团队的张琳博士利用 封闭式荧光成像系统，从 T-DNA 插入或EMS 诱变的拟南芥突变体库中筛选光合电子传递调控的突变体，并重点研究了bfa3的功能，相关结果于 2016 年 4 月发表在国际学术期刊 Plant Physiology[16]。

图6. ppt1突变体和野生型的表型和叶绿素荧光成像图