大白菜叶色突变体的HRM鉴定及其叶绿素荧光参数分析
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大白菜花青素含量及色差指标相关性研究
大白菜花青素含量及色差指标相关性研究林文超;王德森;王海龙;纪纲尚;刘维信【摘要】为了探寻大白菜花青素含量快速测定的方法,本文利用pH差计法和色差仪分别测定了‘城阳青’(普通大白菜)、‘秋宝黄’(黄心白菜)和‘彩凤’3个不同叶色大白菜品种花青素含量以及色差指标,并对6个色泽参数与花青素含量进行了相关和回归分析.结果表明:6个色泽参数均能反映白菜叶片间叶色的细微变化,‘城阳青’和‘秋宝黄’不含花青素,紫色白菜‘彩凤’的花青素主要分布于由外向内的第1～4层叶片.色泽参数L,b,h和C分别与花青素含量呈极显著或显著负相关关系(相关系数分别为-0.85**,-0.58*,-0.49*,-0.58**).以色泽参数值L、a、h 与花青素含量建立了多元回归方程:y =90.24- 1.07x1 +5.65x2 -142.71x3(x1为L 值,x2为a值,x3为h值,y为花青素含量),该回归方程相关系数为0.9629.通过色差计依据建立的回归方程可快速测定紫色大白菜花青素的含量.%To find a fast method for determining anthocyanin content in Chinese cabbage[ Brassica campestris L. Ssp. Pekinensis ( Lour) Olsson] , anthocyanin contents and color indices of 3 different colored Chinese cabbage cul-tivars were measured by the pH method and a colorimeter, respectively. Correlation and regression analysis between the color parameters and contents of anthocyanin was conducted. The results showed that the 6 color indices including L, a, b, C, h, and H could effectively reflect minor changes of leaf color; no anthocyanin was detected in cvs. ' Cheng yang qing' and ' Qiu bao huang'. High contents of anthocyanin were detected in the 1 -4th leaf layer from outside to inside of the purple Chinese cabbage cv. ' Cai feng'. Significant correlations were found between the colorindices (L, b, h, C) and contents of anthocyanin with correlation coefficients of -0. 85 * * , -0. 58 * * , -0.49 * , and -0. 58 * * , respectively. Correlation coefficient of the regression equations was 0. 9629. The regression equation obtained was as following; y =90. 24-1. 07x1 +5. 65x2 - 142. 71x3 ( where x1 was the L value; x2 was the a value; x3 was the h value; y was anthocyanin content). Anthocyanin content in Chinese cabbage can be quickly determined by using a colorimeter and the regression equation.【期刊名称】《青岛农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(028)003【总页数】4页(P201-204)【关键词】紫色白菜;花青素;色差;相关性;回归分析【作者】林文超;王德森;王海龙;纪纲尚;刘维信【作者单位】青岛农业大学园林园艺学院,山东青岛266109;青岛市农科院;青岛市种子管理站;青岛市城阳区科达蔬菜研究所;青岛农业大学园林园艺学院,山东青岛266109【正文语种】中文【中图分类】S634.1大白菜［Brassica campestris L.ssp.pekinensis(Lour)Olsson］为十字花科芸薹属植物，原产我国北方，深受消费者的喜爱。
叶绿素荧光分析技术综述
叶绿素荧光分析技术综述 司继播1，孙明1，刘良云2 （１．中国农业大学 信息与电气工程学院，北京 １０００８３；2. 国家农业信息化工程技术研究中心，北京 １０００８９） 摘要：叶绿素荧光分析技术是在近几年来发展起来的一种探测植物光合作用生理状况的新技术。
荧光与植物的光合作用能力、受胁迫状况、生理状况相关，因此使用叶绿素荧光分析技术，可以得到许多作物本身的相关信息。
由于其精准、快速、简便的特点，且又是一种无损检测方法，使得此项技术已经在农业领域得到了广泛应用。
本文对叶绿素荧光分析技术做了简要介绍，总结了国内外在农业生产检测方面对此技术的应用状况及研究进展，并联系具体实例，对基于作物冠层荧光光谱来诊断作物养分和水分状况的研究进行了分析并提出了初步建议。
关键词：叶绿素荧光；作物；应用研究 中图分类号：TP274+.520 引 言 绿色植物的光合作用是地球上最重要、最普遍、规模最大的反应过程，它包括一系列光物理、光化学和生物化学转变的复杂过程。
光合作用是农业生产的基础，在理论和实践上都具有重大意义。
光合作用产生有机物，是地球上所有生物新陈代谢与能量代谢的基础。
叶绿素荧光现象就是与光合作用密切相关的。
所谓叶绿素荧光现象，直观地说，是指叶绿素在透射光下为绿色，而在反射光下为红色的现象。
红光就是叶绿素受光激发后发射的荧光，究其实质，是因为叶绿素具有光学活性，它吸收光量子而转变成激发态叶绿分子，很不稳定，当它回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
∗ 叶绿素荧光动力学技术之所以能够被称为测定叶片光合功能快速、无损伤的探针[1]，是因为叶绿素荧光动力学技术能更为本质地反映出叶片在进行光合作用时对光能的吸收与传递的过程。
这样的本质性表现在：①荧光对植物叶片本身起着保护作用。
叶绿素易受强光破坏，叶绿素中的镁可被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，再遇铜则成为绿色的铜代叶绿素。
而荧光可以避免使叶片接收过多光能，降低强光对叶片的灼伤。
叶绿素荧光分析方法
叶绿素荧光分析方法叶绿素荧光分析具有观测手续简便,获得结果迅速,反应灵敏,可以定量,对植物无破坏、少干扰的特点。
它既可以用于叶绿体、叶片,也可以遥感用于群体、群落。
它既是室内光合基础研究的先进工具,也是室外自然条件下诊断植物体内光合机构运转状况、分析植物对逆境响应机理的重要方法。
现在人们可以通过叶绿素荧光分析估计量子效率、光合能力,利用荧光参数计算光合电子传递速率、胞间CO2浓度,并且试图利用荧光参数快速筛选遗传变异的植物。
有人甚至预言,将来荧光分析可能会代替气体交换测定。
20世纪80年代以来,调制荧光仪,特别是便携式荧光仪的商品化,使荧光分析在光合作用研究中得到这样广泛的应用,以至如果不懂荧光分析技术,便很难看懂近年的光合作用研究文献。
1.基本原理光合机构吸收的光能有三个可能的去向：一是用于推动光化学反应,引起反应中心的电荷分离及后来的电子传递和光合磷酸化,形成用于固定、还原二氧化碳的同化力(ATP和NADPH)；二是转变成热散失；三是以荧光的形式发射出来。
由于这三者之间存在此消彼长的相互竞争关系,所以可以通过荧光的变化探测光合作用的变化(图4-1)。
实际上,以荧光形式发射出来的光能在数量上是很少的,还不到吸收的总光能的3%。
在很弱的光下,光合机构吸收的光能大约97%被用于光化学反应,2.5%被转变成热散失,0.5%被变成红色(在体内,叶绿京的荧光发射峰在685nm左右)的荧光发射出来；在很强的光下,当全部PSII反应中心关闭时,吸收的光能95%～97%被变成热,而2.5%～5.0%被变成荧光发射[l]。
在体内,由于吸收的光能多被用于光合作用,叶绿素a荧光的量子产额(即量子效率)仅仅为0.03～0.06。
但是,在体外,由于吸收的光能不能图4-1叶绿素分子的光激发被用于光合作用,这一产额增加到0.25～0.30[2]。
在室温条件下,绝大部分荧光来自PS II 天线[1,3],而不是反应中心的叶绿素a分子[4,5]。
大白菜_em_hau_em_胞质雄性不育系的鉴定及不育相关基因结构分析
园艺学报 2012，39（3）：469–476 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@大白菜hau胞质雄性不育系的鉴定及不育相关基因结构分析施展，万正杰*，徐跃进，李雪红，邹瑞昌（华中农业大学园艺林学学院，华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070）摘 要：采用染色体压片法和形态观察法，对大白菜hau胞质雄性不育材料6w-9605A的2个遗传世代（F1和BC6）的染色体数和花器官进行鉴定。
结果表明：F1染色体数为28条；BC6染色体数为20条，与白菜的染色体数相同。
6w-9605A的花药呈三角形，干瘪无花粉，败育彻底。
利用芸薹属作物雄性不育基因线粒体保守序列设计3对引物，在6w-9605A中扩增出867 bp的片段。
基因预测显示，在线粒体基因atp6的下游产生1个新的开放阅读框为orf288，与目前报道的芸薹属作物细胞质雄性不育相关基因orf224、orf138等均不相同，这种新的基因结构特点极有可能就是大白菜hau胞质不育系6w-9605A产生不育的原因。
关键词：大白菜；雄性不育；hau胞质；不育基因中图分类号：S 634.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）03-0469-08 Characterization of the Chinese Cabbage hau Cytoplasmic Male-sterile Line and Sequence Analysis of the Fertility-related GeneSHI Zhan，WAN Zheng-jie*，XU Yue-jin，LI Xue-hong，and ZOU Rui-chang（College of Horticulture and Forestry，Huazhong Agricultural University，Education Ministry Key Laboratory of Horticultural Plant Biology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）Abstract：The male-sterility of the Chinese cabbage（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）line 6w-9605A，a cytoplasmic male-sterile line，was studied in this research. Chromosome squashing revealed that the chromosome numbers in the F1 and BC6 of 6w-9605A were 28 and 20，respectively，and morphologic observation in the BC6 of 6w-9605A showed that the anthers of this line were degenerated and completely abortive. Further，primers were designed based on the conserved sequence of known cytoplasmic male sterility genes in the Brassica species，and a new open reading frame（ORF）of 867 base pairs was amplified from 6w-9605A. Sequence analysis showed that this ORF located downstream from the mitochondrial gene apt6 and was predicted as orf288. Sequence alignment demonstrated that the ORF is different from the sterile genes of pol CMS and ogu CMS，and it may cause the sterility of 6w-9605A.Key words：Chinese cabbage；male-sterility；hau cytoplasm male-sterile line；infertility genes收稿日期：2011–12–19；修回日期：2012–02–21基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目（2009QC027）；湖北省自然科学基金项目（2010CBB01703）* 通信作者Author for correspondence（E-mail：wanzj@）致谢：本文得到华中农业大学植物科学学院李再云教授的修改，在此表示感谢。
HorticRes沈阳农业大学冯辉团队揭示了一种大白菜持绿突变的分子机制
HorticRes沈阳农业大学冯辉团队揭示了一种大白菜持绿突变的分子机制大白菜是我国南北各地广泛栽培的蔬菜作物，通常用于结球、半结球或苗用栽培，在蔬菜周年供应中占据重要地位。
在结球白菜和半结球白菜的栽培后期，以及在叶球贮运保鲜及货架期间，其外叶容易衰老变黄，造成产量损失和产品质量下降。
持绿性是指植株衰老后，叶片仍保持绿色而不变黄的特性，对于提高大白菜采后品质，延长货架期具有特殊重要意义。
2020年1月，Horticulture Research在线发表了沈阳农业大学园艺学院冯辉教授团队题为Defectin Brnym1, amagnesium-dechelatase protein, causes a stay-green phenotype in an EMS-mutagenized Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. pekinensis) line的研究论文。
Fig. 1: Morphological characterizations of wild-type (“FT”) and nym1 mutant plants.该文首次在大白菜EMS诱变群体中鉴定到1份持绿突变体nym1，其持绿性状明显、遗传稳定、综合性状优良。
遗传分析证明了nym1的持绿性呈单基因隐性遗传，遂命名为Brnym1。
MutMap和KASP分析表明，编码脱镁螯合酶Mg-dechelatase(SGR蛋白) 的BraA03g050600.3C基因为持绿突变基因Brnym1。
序列分析表明，Brnym1的第三外显子上一个非同义的SNP(G到A)，导致脱镁螯合酶的保守区域内发生L到F的氨基酸替换。
异源过表达实验表明，野生型大白菜BrNYM1基因可以成功恢复拟南芥SGR缺陷持绿突变体nye1-1的持绿表型。
与野生型相比，nym1突变体的镁脱羧酶活性显著降低。
Brnym1蛋白定位于叶绿体。
大白菜VQ基因家族鉴定及功能分析
大白菜VQ基因家族鉴定及功能分析大白菜VQ基因家族鉴定及功能分析摘要：VQ基因家族是一类参与植物激素信号传导和逆境响应的重要基因家族。
本研究旨在通过生物信息学和功能分析探究大白菜（Brassica rapa）中VQ基因家族的特征和功能。
通过鉴定和分析VQ基因家族，可以深入了解大白菜的激素信号传导和逆境响应机制。
一、引言大白菜是我国重要的经济作物之一，具有重要的食用和营养价值。
随着植物基因组学和生物信息学的发展，越来越多的研究发现大白菜中参与植物生长发育和逆境响应的基因家族。
VQ基因家族是其中一个重要的基因家族，目前关于大白菜中VQ基因家族的研究报道较少。
二、材料与方法1. 数据收集：从公共数据库中下载大白菜基因组序列和已知的VQ基因序列。
2. 生物信息学分析：利用BioPerl和BLAST软件进行序列比对和分析，得到大白菜中VQ基因家族的序列特征和进化关系。
3. 表达模式分析：通过大白菜基因表达数据库和实时定量PCR技术，研究VQ基因家族在不同发育阶段和逆境处理中的表达模式。
4. 功能分析：利用基因转化技术，研究VQ基因家族参与植物生长发育和逆境响应的功能。
三、结果与讨论1. VQ基因家族的特征：通过生物信息学分析，发现大白菜基因组中有多个VQ基因家族成员，具有VQ保守序列和TIFY结构域。
2. 进化关系分析：VQ基因家族成员在进化上分为了不同的亚家族，并与拟南芥中的VQ基因家族有一定的相似性。
3. 表达模式分析：在大白菜生长发育过程中，部分VQ基因家族成员表达量在不同发育阶段变化明显。
在逆境处理中，一些VQ基因家族成员受到外界逆境的诱导，表达量显著上调。
4. 功能分析：转基因大白菜植株在生长发育和逆境响应方面表现出明显的差异。
部分VQ基因家族成员的过表达可以促进植株的生长发育，增强逆境抗性。
四、结论通过本研究对大白菜VQ基因家族进行鉴定和功能分析，揭示了其在植物生长发育和逆境响应中的重要作用。
叶绿素荧光分析技术与应用优秀ppt
叶绿素荧光诱导动力学
叶绿素荧光诱导动力学是指经过暗适应的绿色植物材料当转到 光下时，其体内叶绿素荧光强度会有规律的随时间变化。根据 现在国际上的统一命名，可把荧光诱导曲线(图1)划分为： O(原点)→I(偏转) →D(小坑)或pl(台阶) →P(最高峰) →S(半稳 态) →M(次峰) →T(终点)这几个相(phase)。有时在O和I之间还 可辨认出一个扔点称为J相。其中O→P相为荧光快速上升阶段 (1－2s)，从P→T为荧光慢速下降(猝灭)阶段(4－5s），在此阶 段，往往出现复杂的情况，有时没有M峰，有时出现几个渐次 降低的峰，因叶片的生理状态不同而异。一般而言，遭受环境 胁迫的叶片M峰消失，而生理状态良好的叶片往往在P峰之后 有几个峰出现。这可能反映了同化力形成和使用之间从不平衡 到平衡的一个快速的调节过程。
TechnicalSpecifications
Items supplied: Control unit, remote sending unit,10 dark adaption leaf clips, 4 AA batteries, carryingcase, serialcable, downloading software and instruction manual.
amplifier. Sampling rate: Auto switching from 10 to 1,000 points per second
depending on test phase. Test duration: A djustable from 2 seconds to 45 minutes. Storage capacity: Up to 2,500 data sets and 6 traces totaling 45 minutes of
叶绿素荧光分析
叶绿素中存在一定量的叶绿素蛋白复合物，其中影响光能吸收的因素是叶绿素蛋白复合物的含量和成分比例，捕光蛋白复合体中叶绿素a/b值较为关键，较高比例的捕光蛋白复合体（LHCP）有利于弱光下植物吸收和利用光能(Sane,1977)。
叶绿素a/b值，即叶绿素a与叶绿素b的比值，也与光合作用速率有密切关系：比值低，有利于吸收光能；比值高，在强光下的光合速率通常较高，抵抗光抑制能力较强(储钟稀等，1986)。
同时，叶绿素含量与该比值呈负相关，即叶绿素含量高，叶绿素a/b比值较低，作物叶色较深。
也有人报道认为叶绿素a/b比值与光合作用速率呈显著的负相关，该比值也可能是影响光合作用速率的内在因子之一。
“光能被色素分子吸收以后，并不是全部用于光合作用：一部分光能被传递到光反应中心，用于光化学反应；一部分光能可以辐射成荧光的方式被耗散掉；另一部分光能以热辐射的方式耗散掉，色素发射荧光的能量与用于光合作用的能量相互竞争，这是以叶绿素a荧光通常被作为光合作用无效指标的依据”(植物生理学 2003:123)，此外分子的荧光特性是由该分子的化学性质和周围环境因素的相互作用所控制的，因此叶绿素荧光测量是以叶绿素a荧光作为探针，探测和研究植物光合生理状况及各种外界因子对其的影响，是无损伤研究光合作用过程的重要手段(林世青等 1992; Krause and Weis 1988)。
植物叶片荧光动力学参数与光合特性的关系在自然条件下，叶绿素荧光和光合作用的关系十分密切(Bolhar-Nordenkampf H Ret al. 1989；Genty B et al. 1989；Schreiber U et al. 1994 )，一方面是当强光持续照射植物时，为了避免叶绿体吸收光能超过光合作用过程中光化学反应的消耗能力及过量的光能灼伤光合机构，荧光起到了重要的保护作用：一部分光能以荧光的方式被耗散掉(Gilmore A and Gofindjee，1999)；另一方面，自然条件下叶绿素荧光和光合速率一般是呈负相关的，当荧光变弱时光合速率就高，反之亦然，植物的营养受胁程度与光合作用的荧光特性有着密切的关系(徐彬彬等 2000；Krause G H and Weis E 1984；Liehtenthaler H K and Rinderle U 1984；Mefarlane J C er al. 1980；Sehreiber U and Bilger W 1987；)，因此叶绿素荧光可作为营养诊断探测叶片光合功能的快速、无损伤探针(张木清 2005)通过植物荧光特性探测可以了解植物的生长发育以及对逆境胁迫、病虫害等的生理响应，与“表观性”的气体交换指标相比叶绿素荧光更具有反映“内在性”的特点(Lin S Q etal. 1992)。
橙色大白菜球叶细胞有色体的超微结构观察
橙色大白菜球叶细胞有色体的超微结构观察
橙色大白菜球叶是由育种工作者通过遗传变异培育出的一种具有颜色特征的新品种，
其具有独特的视觉效果和丰富的营养成分，备受消费者的青睐。
然而，对于其细胞超微结
构的认识仍然相对薄弱，本文将对橙色大白菜球叶细胞有色体的超微结构进行观察和描述，以期提高对该植物细胞的认识。
实验采用透射电子显微镜（TEM）对橙色大白菜球叶细胞有色体进行观察。
首先，将
橙色大白菜球叶的叶片进行取样，用4%的聚乙烯亚胺（PVA）进行固定，然后用5%的戊二
醛和2.5%的醋酸进行预固定。
将样品切成薄片，用乙醇进行脱水和干燥，再用环氧树脂进行包埋处理，最后使用透射电子显微镜观察样品的超微结构。
通过TEM观察，我们发现橙色大白菜球叶细胞有色体呈现出带状结构，处于细胞核的
空间内。
有色体外表面覆盖着一层膜状结构，该膜状结构可能是由比色体薄的膜片所组成。
有色体内部的染色质的形态呈现出条带状，其由黑色及灰色交替排列的颗粒组成。
在颗粒
的间隙中，还可以看到线粒体、内质网和高尔基体等胞内器官。
需要注意的是，橙色大白菜球叶细胞有色体的超微结构呈现出明显的异质性，即不同
部位的有色体组成和染色体的形态存在差异。
在一些区域，有色体上黑色颗粒比例更高，
而在另一些区域，灰色颗粒比例更高，这可能与染色体上基因的分布和表达有关。
总的来说，橙色大白菜球叶细胞有色体的超微结构可以提供很多细节性的信息，关于
其染色质的形态和分布、颗粒的组成及数量，还有其他胞内器官之间的关系等。
这些信息
有助于深入理解该植物的遗传特征和代谢机制，为其育种和栽培提供了重要的参考。
大白菜种皮颜色基因的QTL定位与分析
大白菜种皮颜色基因的QTL定位与分析原玉香;张晓伟;蒋武生;姚秋菊;张强;赵艳艳;耿建峰【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2012(027)001【摘要】利用已构建的包括457个标记位点的大白菜分子遗传图谱,采用多QTL 复合作图方法(MQM),通过目测和利用色差计测量两种方法对种皮颜色性状进行了QTL定位和分析.结果表明,共得到种皮颜色的QTLs 9个,其中最重要的QTLs位于A6上,命名为Sc-1,与利用色差计测量法检测到的控制种皮颜色性状L值QTL(ScL-2)和b值(Scb-2)位置完全相同,解释80.4％～ 100％的表型变异.【总页数】5页(P74-78)【作者】原玉香;张晓伟;蒋武生;姚秋菊;张强;赵艳艳;耿建峰【作者单位】河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州450002;河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州450002;河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州450002;河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州450002;河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州450002;河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州450002;河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州450002【正文语种】中文【中图分类】S634.1【相关文献】1.大白菜叶球相关性状的QTL定位与分析 [J], 于拴仓;王永健;郑晓鹰2.水稻耐淹性的QTL定位与候选基因分析 [J], 饶玉春;林晗;肖飒清;吴仪;张月;王盛;胡佳青;薛大伟3.大白菜叶色相关性状的QTL定位与分析 [J], 徐东辉;孙日飞;张延国;原玉香;康俊根;武剑;张慧;宋晓飞;李晓楠;宋一沫;王晓武4.大白菜部分形态性状的QTL定位与分析 [J], 于拴仓;王永健;郑晓鹰5.大白菜耐热性QTL定位与分析 [J], 于拴仓;王永健;郑晓鹰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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园艺学报，（）：– 2014411122152224 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@收稿日期：2014–08–22；修回日期：2014–10–24基金项目：河北省海外高层次人才百人计划项目（E2013100011）；河北省杰出青年科学基金项目（C2013204118）；‘十二五’农村领域国家科技计划课题（2012AA100202-5）；农业部农业科研杰出人才培养计划项目（2130106）；高等学校博士学科点专项基金项目（20121302110006）大白菜叶色突变体的HRM 鉴定及其叶绿素荧光参数分析刘梦洋，卢 银，赵建军，王彦华，申书兴*（河北农业大学园艺学院，河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室，河北保定 071000）摘 要：将大白菜经甲基磺酸乙酯（EMS ）诱变种子获得的42株叶色突变体按照生殖时期叶片颜色和叶绿素含量分为9种类型：深绿色、灰绿色、绿色、浅绿色、白绿色、白浅绿色、黄绿色、黄浅绿色、黄色；利用高分辨率熔解曲线（high resolution melting ，HRM ）技术对叶绿素荧光基因HCF164突变进行了筛选并结合叶绿素荧光参数测定，获得了1株黄绿色高光合效率突变体A29，1株黄绿色光合结构损伤突变体A35和1株浅绿色光合电子传递受阻突变体A21；对另外7个叶色相关基因的突变进行了HRM 鉴定，表明叶绿素相关基因ATRCCR 、CLH2、PORA 突变可能是造成18个突变体叶色变化的主要原因，黄叶特异基因家族YLS 突变与叶色变化也有关系。
关键词：大白菜；诱变；突变体叶色；HRM ；叶绿素荧光中图分类号：S 634.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X （2014）11-2215-10HRM Identification and Chlorophyll Fluorescence Characteristics on Leaf Color Mutants in Chinese CabbageLIU Meng-yang ，LU Yin ，ZHAO Jian-jun ，WANG Yan-hua ，and SHEN Shu-xing *（College of Horticulture ，Agricultural University of Hebei ，Key Laboratory for Vegetable Germplasm Enhancement and Utilization of Hebei ，Baoding ，Heibei 071001，China ）Abstract ：Forty-two leaf color mutants of Chinese cabbage obtained through EMS seeds mutagenesis were used as materials in this study. According to leaf color and leaf chlorophyll content at generative growth mutations were suggested to be divided into 9 types ：Dark green ，gray-green ，green ，light green ，white-green ，light white-green ，yellow-green ，light yellow-green and yellow. By detecting the nucleotide variation of the gene HCF164 related to chlorophyll fluorescence using HRM technology and by measuring chlorophyll fluorescence characteristics ，we identified one yellow-green leaf color mutant A29 with high photosynthesis efficiency ，one yellow-green leaf color mutant A35 with photosynthetic structure damages ，one light green mutant A21 with photosynthetic electron transport obstruction. Through identifying other 7 leaf-color-related genes by HRM ，mutation of chlorophyll-related genes ATRCCR ，CLH2 and PORA could be the main reason resulted in 18 leaf color mutants ，mutation of yellow-leaf- specific genes was also affected the variation of leaf color.* 通信作者 Author for correspondence （E-mail ：shensx@ ）2216 园艺学报41卷 Key words：Chinese cabbage；EMS mutation；leaf color；HRM；chlorophyll fluorescence叶色突变体作为研究植物叶绿素合成分解途径、遗传表达机理、光合作用机制的特殊材料，具有重要的研究意义。
高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）技术，可以辅助表型筛选，高效精细地鉴定点突变位点。
将HRM技术应用于芸薹属甲基磺酸乙酯（EMS）诱变育种中具有巨大的发展潜力。
该技术是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况（Gingerast et al.，2005；Hoffmann et al.，2007），利用高通量遗传变异扫描系统Lightscanner，高灵敏高特异性地扫描最长达400 bp的扩增子中是否存在变异。
目前在模式植物拟南芥中已经鉴定出了突变体ch1的相关基因（Block et al.，2002；Pontier et al.，2007）。
大白菜和拟南芥同属十字花科，存在大量同源基因，利用拟南芥相关基因鉴定大白菜叶色突变体，为大白菜叶色突变机理的研究提供了条件。
本试验利用经EMS 诱变获得的大白菜叶色突变体，对其在生殖期的叶片光合特性进行了研究，并通过HRM技术对相关基因的碱基变化进行了鉴定，旨在为创造可稳定遗传的叶色突变材料奠定基础，为叶色突变体的应用提供更多的理论依据。
1 材料与方法1.1材料选用经EMS诱变大白菜自交系A03的种子获得的叶色突变体（卢银等，2014）M2世代42株及野生型A03作为试验材料。
于2013年9月播种于温室，同年11月大株留种，2014年1月移栽，进入生殖生长时期，正常管理。
1.2方法1.2.1 叶绿素含量与叶绿素荧光参数的测定参照刘绚霞等（2004）的方法测定叶绿素含量。
采用德国WALZ公司生产的调制式荧光成像系统（MINI-IMAGING-PAM）测定叶绿素荧光参数（Genty et al.，1989；王俊玲等，2011）——PSⅡ最大光化学量子产量F v/F m、光化学荧光猝灭系数q P、非光化学荧光猝灭系数q N、实际光化学量子产量Y（Ⅱ）、调节性能量耗散的量子产量Y（NPQ）、非调节性能量耗散的量子产量Y（NO）、吸光系数Abs。
1.2.2 高分辨率熔解曲线（HRM）分析分别取叶色突变体及野生型新鲜叶片采用CTAB法提取DNA，利用微量分光光度计K5600测定DNA模板浓度，分别稀释至100 ng · µL-1。
叶色基因来源于大白菜基因组数据库（http：//），共发现大白菜6个黄叶特异基因（YLS2-1、YLS2-2、YLS9、YLS7、YLS4、YLS8）及5个叶绿素相关基因（ATRCCR、CLH2、HCF164、PORA、HCF107）。
应用软件Premier 5分别设计了14和12对引物（表1），扩增片段为50 ~ 400 bp。
PCR反应体系参考Xiao等（2013）的报道。
样品在避光96孔板中（野生型3次重复）进行PCR 扩增，PCR反应总体系10 µL，体系中各组分含量为：10 PCR Buffer（含Mg2+）1 µL，2.5 mmol· µL-1 dNTPs 0.8 µL，1 U Taqase 0.1 µL，50 ng· µL-1 Forward primer 0.5 µL，50 ng· µL-1 Reverse primer 0.5 µL，100 ng· µL-1模板DNA 1 µL，其它用灭菌双蒸水补齐。
PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，退火温度30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。
扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，保证扩增出单一条带。
11期刘梦洋等：大白菜叶色突变体的HRM鉴定及其叶绿素荧光参数分析 2217表1 叶色相关引物信息Table 1 The information of leaf-color-related primers白菜基因Brassica rapa gene 白菜注解Brassica rapa annotation拟南芥基因A. thalianagene引物名称Primername引物Primer（5′–3′）片段位置Fragmentlocation片段大小/bpFragmentsizeLY1 F：TCCACGGAGAAGTCATAGR：CGTTAGCGAAGTAAAGGTC368 ~ 722 355YLS2-1 黄叶特异基因2-1Yellow-leaf-specific gene 2-1AT3G51430LY2 F：TATTACATCAACGAGGAGCR：AAGAAAGGGTATCTAAACG869 ~ 1 097 229LY3 F：ATACCTCCACTCGCTCTT R：TCACGGATGCTTCTTACA 441 ~ 763 323YLS2-2 黄叶特异基因2-2Yellow-leaf-specific gene 2-2AT3G51430LY4 F：GAGATGCCATTAGCGAAGTR：GACGGATGAAGCAGAAGG616 ~ 837 222YLS9 黄叶特异基因9Yellow-leaf-specific gene 9 AT2G35980 LY5 F：TCTACGGTCCATCAGTCCR：TGAGCCAGAAGATAAGAGC29 ~ 184 156LY6 F：GACCATCTTGCGGACTTGR：TCGCTTGCTGCTCATACA1 180 ~ 1 325 146LY7 F；TAACACGCCTCCATTGCTR：GGTCTCCCATTGCCCTGA243 ~ 557 315 LY8 F：TTGCGTTTGCTATTGGTGR：TCTGCTGCTACTATGGTGA59 ~ 294 146YLS7 黄叶特异基因7Yellow-leaf-specific gene 7AT5G51640LY9 F：ATGATGTGCCTTCTTTGGR：GTTGGTCGAGCTTGAGTT700 ~ 950 251LY10 F：AGAAGCACTATCGAACCCTG R：CAGCCGTAAGTAACCATTTC 971 ~ 1 072 102YLS4 黄叶特异基因4Yellow-leaf-specific gene 4AT5G11520LY11 F：CCATGTTGGCTGAGGAATR：CACGGATCAAGGAGTATCTT1 215 ~ 1 607 393LY12 F：TTAGGAGCAATCACCAGCR：TATGAAGGACAAGCAGGA29 ~ 115 87LY13 F：AAACTCCTGCTTGTCCTT R：AGCGTCTCGTCGTCATAC 94 ~ 476 383YLS8 黄叶特异基因8Yellow-leaf-specific gene 8AT5G08290LY14 F：CAGCCCACGACCTTTCCTR：AGGTGCTTGCGTCTGTTG43 ~ 302 260CH1 F：AAAGACCTAGTTCGTCACCCTG R：ACGCTCCAACCAAACCTCAA 750 ~ 1 004 255ATRCCR 拟南芥红绿色素分解产物还原酶Arabidopsis thaliana redchlorophyll catabolite reductase AT4G37000CH2 F：GGGAAGACTTATGGATTGR：TAGATTTGGGTAAACTGG1 774 ~ 1 882 109CH3 F：CTTGCCTCTAATCCCTTCAR：GATACTCGTCCGACCTAA184 ~ 500 317CLH2 叶绿素酶2Chlorophyllase 2AT5G43860CH4 F：GTCCAAATGCCCGTAATCR：TTCCACCACAAGTAACACCA220 ~ 596 377CH5 F：CAAGTGCGTTGACATTCTR：CATTTATAGGGTTAGGGAG105 ~ 393 289CH6 F：TCGTAAGGCAAGGCTGAAR：GGAGAAATTGGTGGTGGA841 ~ 1 050 210CH7 F：CAGAAGCAACAGCGACTC R：GTGGATAATGGCTCAACT 929 ~ 1 037 109HCF164 高叶绿素荧光164High chlorophyll fluorescence 164AT4G37200CH8 F：GAGCCATTATCCACCACCR：GCCAGATTCTTCCGAGCC1 024 ~ 1 149 126CH9 F：CTTCTCGCTAACTTCCCAAACR：AGACCTCGGCTTCATTCG19 ~ 104 86CH10 F；ATACAACCAGGGTAGAGG R：CGATGATAGATGGAGGAG 378 ~ 519 142PORA 原叶绿素质化还原酶Protochlorophyllideoxidoreductase AAT5G54190CH11 F：AAAGTGCCCTAAATGGTTR：GTGAGGCAGTTCGTTGAT1 042 ~ 1 194 153HCF107 高叶绿素荧光107High chlorophyll fluorescence 107 AT3G17040 CH12 F：CCAAACGCTTGCCTTACTR：GATATGGTGGCCTGCTTA987 ~ 1 064 78PCR扩增产物在Lightscanner（Idaho Technology）仪器上进行HRM鉴定，与野生型比较熔解曲线，确认突变株（Lochlainn et al.，2011）：样品在70 ~ 96 ℃的温度条件下逐渐减链，减链速度为0.1 ℃ · s-1。