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用核糖体RNA+ITS区序列寡核苷酸探针鉴定临床常见真菌

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表 ." )*+、 反向杂交法检测真菌和非真菌病原体 （ 阳性数 / 标准菌株和临床分离菌株总数） 种特异性探针杂交阳性数 真菌和细菌菌种 白色念珠菌 热带念珠菌 光滑念珠菌 烟曲霉 黄曲霉 新型隐球菌 近平滑念珠菌 假热带念珠菌 解脂念珠菌 克柔念珠菌 季也蒙念珠菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 人血白细胞 S)O 阳性数 P)A: !& 6 !& !4 6 !4 060 363 !6! ,6, &6& ,6, ,6, 363 363 463 463 463 46! !& 6 !& 4 6 !4 460 463 46! 46, 46& 46, 46, 463 463 463 463 463 46! P$5> 4 6 !& !4 6 !4 460 463 46! 46, 46& 46, 46, 463 463 463 463 463 46! P*:A 4 6 !& 4 6 !4 060 463 46! 46, 46& 46, 46, 463 463 463 463 463 46! PYZ7 4 6 !& 4 6 !4 460 363 46! 46, 46& 46, 46, 463 463 463 463 463 46! PY:A 4 6 !& 4 6 !4 460 463 !6! 46, 46& 46, 46, 463 463 463 463 463 46! P)5L 4 6 !& 4 6 !4 460 463 46! ,6, 46& 46, 46, 463 463 463 463 463 46!
万方数据
［ 收稿日期］ ! 3##4 T #4 T "% ［ 作者简介］ ! 黄! 媛 （ "%1# T ） ， 女， 北京市人， 硕士， 主治医师。
-M3 公司合成， 序列见表 ! 。
表 !" 真菌通用引物和特异性寡核苷酸探针序列 引物和探针 #$% 区引物 " #$%! " #$%杂交探针 " 黄曲霉 " 烟曲霉 " 白色念珠菌 " 热带念珠菌 " 光滑念珠菌 " 新型隐球菌 &’()*+ +)* )++ +$) ++$ )$$ $$(,’ &’(*+) +)) )++ )$$ $+$ $$$ $)(,’ &’(+** $)$ +++ )$$ +)+ +)) ++(,’ &’()$$ +$$ $$+ +*) *+) $$+ **(,’ &’(+)$ )*+ )+) $$$ )$+ +$$ +)(,’ &’(*$* +$+ +)+ +)) +$) $)$ $$(,’ &’($)) *$+ **$ *++ ))$ *)* *(,’ &’())$ ))* )$$ +$$ *+$ +$* )(,’ 序" 列
（ (5567689:; <=>06987，(?8;:@A =5 B67698CA B:;6?87 +?6:D?:>，E:6F6DG! "###$% ，HI6D8） ［ #89)5.*)］ ! ;8<(*)+=(：*= :>98/76>I 8 @:9I=; 5=C ;:9:?96DG 8D; 6;:D965A6DG ?76D6?877A 6@0=C98D9 5JDG6K >():,/9：LJDG87 JD6M:C>87 0C6@:C> 8D; -’( 0C=/:> N:C: ;:>6GD:; 5C=@ 9I: 6D9:CD87 9C8D>?C6/:; >08?:C（ )*+ ） K *I: -’( =5 "" >0:?6:> =5 5JDG6 N:C: 8@07656:; N69I JD6M:C>87 0C6@:C> @=;656:; /A /6=96D 89 .O9:C@6D87K *I: PH& 0C=;J?9> N:C: 9I:D 6;:D9656:; /A C:2 M:C>: IA/C6;6Q896=D N69I , >0:?656? 0C=/:> ［ *()5-5( (67-8()9（ :*(6） ， *; <=>:-8(6-9（ :?=>） ， *; 26(7=(<( （ :%6(） ， *=@:<>8>8. 8’9 )4>A>=B()9（ :*=@） ，#9:4=2-66’9 A’B-2(<’9（ :3’B ） ，#; A6(C’9（ :36( ） ］ K !(961)9：RD6M:C>87 0C6@:C> ?8D 8@0765A 9I: -’(> 5C=@ "" >0:?6:> =5 5JDG6K S8?I >0:?656? 0C=/: =D7A IA/C6;6Q:; 69> ?=CC:>0=D;6DG 98CG:9 8@=DG , >0:?6:> =5 5JDG6K ?,-@ *169+,-：*I: PH& ?=@/6D:; N69I C:M:C>: IA/C6;6Q896=D 6> C806;，>6@07:，8D; >0:?656? 5=C ;:9:?96=D 8D; 6;:D9656?896=D =5 @:;6?877A 6@0=C98D9 5JDG6K ［ A(2 B,5/9］ ! @:;6?87 5JDG6； 6D9:CD87 9C8D>?C6/:; >08?:C； 0=7A@:C8>: ?I86D C:8?96=D； C:M:C>: IA/C6;6Q896=D； -’(，C6/=>=2 =76G=DJ?7:=96;: 0C=/:> @87； ! ! 目前， 深部真菌感染的快速诊断仍然是一个难题， 快速 鉴定致病真菌菌种对于选择适宜的抗真菌药物治疗很有必 要。只依靠临床症状不可能鉴定真菌到种。传统的真菌培 养菌种鉴定需要 $ U , ;， 耗时长， 检出率低， 据报道 4.V U 1.V 侵袭性念珠菌病和大多数侵袭性曲霉病血培养检测结
." 结果
设计种特异性探针的 M 种真菌的参考菌株和来自血液、 脑脊液、 痰、 咽拭子等标本的临床分离菌株 （ 白色念珠菌 !& 株、 热带念珠菌 !4 株、 光滑念珠菌 0 株、 新型隐球菌 , 株、 黄 曲霉 ! 株、 烟曲霉 3 株） 的 <E+， S)O 扩增后， 用琼脂糖凝胶 电泳法和探针杂交法检测结果均为阳性 （ 表 3） ； 没有设计种 特异性探针的其他真菌标准菌株和临床分离菌株 <E+ S)O 扩增后用凝胶电泳法检测结果均为阳性， 探针杂交法检测结 果均为阴性， 所试真菌 <E+ 扩增片段长度约为 &M4 XP； 所试 细菌和人血白细胞 <E+ 扩增后用凝胶电泳法和探针杂交法 检测， 结果均为阴性 （ 表 3） 。
军事医学科学院院刊" 344- 年 !4 月 第 30 卷 第 & 期"
入液体石蜡油 &4 !: 防止蒸发。于 U-/ 预变性 &-4 B， ,& 个 循环， 每个循环包括 U-/ 变性M4 B， &&/ 退火 -& B， .3/ 延伸 M4 B， 最后 .3/ 延伸 M44 B。设立阳性、 阴性对照。 !# ," 寡核苷酸探针加尾和固定 寡核苷酸探针 344 P7>:， 末端脱氧核苷酸转移酶 （ $<$， 购自 CV# 公司） !M4 K， $<$ 缓冲液 34 !:， R$$S ! !7>:， 加去 离子水补至 344 !:。,./ 孵育 M4 789。取加尾探针 M P7>: 6 7:， 用 EAWI 变性后点在硝酸纤维素膜上， 置 3&- 97 紫外灯 下固定 & 789， 此膜可立即杂交或用去离子水泡后晾干备用。 !# -" 反向杂交 !4 !: 生 物 素 标 记 的 S)O 产 物 加 入 等 体 积 变 性 液 （ EAWI(;<$+） 室温 & 789。在 杂 交 袋 中 加 入 ! 7: 预 热 的 （ &4/ ） 杂交液 （ , Q %%)， 4G !J %<% ） 和变性的生物素标记 的 S)O 产物， 混匀， 将点有加尾寡核苷酸探针的硝酸纤维素 膜放入杂交袋中， &4/ 杂交 &4 789。膜严格漂洗， 分别用 !7: 杂交液洗膜 , 次， 3 次室温， 各 ! 789， ! 次 &4/ !& 789， 然后 用漂洗液 （ ! Q %%)， 4G !J %<%） 漂洗 ! 789。漂洗后的膜置于 ! 7: ,J 牛血清白蛋白液中， 加入链亲和素(碱性磷酸酶结合 物 （ %+(+S ） ! !D 6 7:， ,./ 作 用 !& 789。最 后 加 入 显 色 剂 EV$，V)#S 显色。
’()(*)+,- .-/ +/(-)+0+*.)+,- ,0 *1+-+*.112 +34,5).-) 06-7+ 82 69+-7 ,1+7,-6*1(,)+/( 45,8(9 ,0 ):( $%& 5(7+,- ,0 5!"#

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粗糙链孢霉的四分子分析

粗糙链孢霉的四分子分析

粗糙链孢霉的四分子分析粗糙链孢霉（Fusarium spp.）是一类重要的真菌属，存在于土壤、植物、食物和环境中。

它们是常见的植物病原菌，同时也是人和动物的致病菌。

粗糙链孢霉具有广泛的遗传多样性，因此其分子分析成为研究者们研究该菌属的重要手段之一四分子分析是一种基于利用四个核糖体RNA基因（18SrDNA，ITS，28SrDNA和5.8SrDNA）来研究粗糙链孢霉的分子方法。

这四个基因都具有高度保守性和可变性序列，既可以用于确定种属和亚种，也可以用于比较不同菌株之间的遗传关系和进化关系。

下面将详细介绍四分子分析在粗糙链孢霉研究中的应用。

首先，18SrDNA是真菌核糖体RNA基因的一部分。

通过对不同粗糙链孢霉菌株的18SrDNA序列进行比对和分析，可以建立菌株之间的系统发育树，确定它们的亲缘关系。

例如，研究者们通过比较不同菌株的18SrDNA 序列，发现不同的粗糙链孢霉菌株可以分为几个主要的物种群，这有助于更好地理解该菌属的遗传多样性和分类学。

此外，18SrDNA序列的变异还可以用于区分不同的亚种或菌株的变异程度。

其次，ITS（Internal Transcribed Spacer）是连接18S rDNA和28S rDNA的一个高变性序列区域。

ITS序列在粗糙链孢霉研究中被广泛应用于种属鉴定和系统发育分析。

通过测定不同菌株的ITS序列，研究者们可以确定它们属于哪个物种，以及它们之间的亲缘关系。

例如，通过对不同菌株的ITS序列进行比较，研究者们发现了一些新物种和新亚种，并修正了传统分类学中存在的一些问题。

此外，ITS序列的变异还可以用于研究菌株之间的遗传进化关系和地理分布。

再次，28SrDNA是真菌核糖体RNA基因的另一个重要组成部分。

通过分析不同菌株的28SrDNA序列，研究者们可以进一步确认它们的种属和亚种，以及它们的系统发育关系。

此外，28SrDNA序列的变异还可以用于研究菌株之间的多样性和表型变异。

rDNA测序在酵母菌和丝状真菌鉴定中的临床应用评价

rDNA测序在酵母菌和丝状真菌鉴定中的临床应用评价

文章编号：1001-8689(2021)05-0432-05rDNA 测序在酵母菌和丝状真菌鉴定中的临床应用评价卢玲玲 单洪波 许育绚* 钟钰芳 丁进龙 王慧兰(杭州艾迪康医学检验中心有限公司 杭州 310000)摘要：目的 评价核糖体RNA(rDNA)测序，在临床酵母菌和丝状真菌鉴定中的应用价值。

方法 收集61株真菌(包括5株标准菌株，9株室间质评酵母菌，24株临床酵母菌，23株临床丝状真菌)，通过设计通用引物ITS 和26S D1/D2，对61株真菌进行PCR 扩增并对扩增产物进行双向测序，将获得的所有序列在Seqman 中打开，选取ITS 和26S D1/D2正反向序列无重叠峰片段，进行BLAST 核酸序列比对。

结合Mycobank 真菌分类信息以获得菌株鉴定结果。

结果 61株真菌全部扩增成功，剔除杂峰后，所有菌株联合ITS 和26S D1/D2测序鉴定，100%菌种能鉴定到属或群，97.0%(32/33)的酵母菌与73.9%(17/23)的丝状真菌准确鉴定到种。

结论 经优化后的核糖体RNA(rDNA)测序，能准确快速的鉴定临床常见真菌与疑难菌。

关键词：核糖体；真菌；基因测序中图分类号：R446.5 文献标志码：AApplication and clinical evaluation for DNA sequencing analysis in identification ofyeasts and filamentous fungiLu Ling-ling, Shan Hong-bo, Xu Yu-xuan, Zhong Yu-fang, Ding Jin-long, and Wang Hui-lan(Hangzhou Adicon Clinical laboratory, Inc., Hangzhou 310000)Abstract Objective To evaluate the value of ribosomal RNA (rDNA) sequencing in the identification of clinical yeasts and filamentous fungi. Methods 61 fungi were collected (including five standard strains of yeasts, nine strains of yeasts of external quality assessment, 24 strains of clinically isolated yeasts, and 23 strains of filamentous fungi), PCR amplification and two direction gene sequencing were performed by the universal primer 1TS and 26S D1/D2 of fungal rDNA gene. All sequences obtained were opened in Seqman, the fragments without overlapping peaks were selected for blast nucleic acid sequence comparison and were combined with Mycobank to obtain the information of species identification. Results All the 61 strains were amplified successfully. After removing the heteropeaks, all the strains were identified by combining with ITS and 26S D1/D2 sequencing. 100% of the strains could be identified to genera or groups, and 97.0% (32/ 33) yeast and 73.9%(17/23) filamentous fungi could be identified to species accurately. Conclusion The optimized ribosomal RNA (rDNA) sequencing could accurately and rapidly identify clinical common and difficult fungi.Key words Ribosomal; Fungus; DNA sequencing收稿日期：2020-05-08作者简介：卢玲玲，女，生于1984年，硕士，研究方向为临床微生物检验，Email:****************。

多样性扩增引物选择—ITS

多样性扩增引物选择—ITS

多样性扩增引物选择—ITS上篇给⼤家介绍了如何选择合适的16S扩增引物，那么作为研究真菌的常⽤⽅法—ITS扩增，引物的选择同样是关键。

1ITS简介ITS(Internal Transcribed Spacer)，内源转录间隔区，分为两个区域：ITS1和ITS2，ITS1位于真核⽣物rDNA序列18S和5.8S之间，ITS2位于真核⽣物rDNA序列5.8S和28S之间。

ITS对区分所有真菌有72%的成功率，因此ITS扩增是⽬前研究真菌的常⽤⽅法之⼀。

在2011年，ITS被正式确定为区分真菌的条形码，并于2012年发表在PNAS上[1]。

图1 ITS区域⽰意图在真核细胞中，28S核糖体⼤亚基rRNA基因（LSU）是某些真菌常⽤的系统发育marker，在早期分化谱系和⼦囊菌酵母中具有较好的物种分辨率，但在其他⽅便略低于ITS；18S核糖体⼩亚基rRNA基因（SSU）进化速率⽐较保守，在系统发育中较适⽤于种级以上阶元的分类，其同源基因16S是细菌的鉴定基因，但18S在真菌中的⾼变区较少；ITS长度约为500bp，属于中度保守的区域，其保守性基本上表现为种内相对⼀致，种间差异⽐较明显，表现出极⼤的序列多态性，被⼴泛应⽤于⽣物种间系统发育和研究。

2引物的选择ITS具有⾼拷贝数（≥200个），长度短（600-800bp）的特点，利⽤通⽤引物很容易被扩增出来；包含保守与变异序列，可根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进⾏特异性扩增⽐较。

种内变异还显⽰在ITS⽚段⼤⼩上，ITS区在核糖体RNA中进化较快，可在同⼀属间甚⾄群体间发⽣变化。

其中ITSII区在种间变异性较⾼（22%），种内变异性较低<3%）。

Tedersoo[2]总结了⽂献中提供的可供选择的ITS引物，但这些引物并不是尽善尽美，有些引物对真核⽣物专⼀，可能导致扩增出许多⾮真菌的序列，影响测序的序列数量。

有些对真菌专⼀，⼜可能导致⼀些重要类群的丢失。

大丽轮枝菌核糖体基因its区段的特异扩增

大丽轮枝菌核糖体基因its区段的特异扩增

大丽轮枝菌核糖体基因its区段的特异扩增大丽轮枝菌（学名：Ganoderma lucidum），又称灵芝，是一种具有重要药用价值的真菌。

其内部包含着丰富的活性成分，并因其独特的外观特征而备受关注。

为了对大丽轮枝菌进行准确鉴定和分类，科研人员常常利用核糖体基因ITS区段进行特异扩增。

本文将详细介绍大丽轮枝菌核糖体基因ITS区段的特异扩增方法，以及其在研究和医疗领域的指导意义。

首先，我们需要明确大丽轮枝菌核糖体基因ITS区段的作用。

ITS 区段是核糖体RNA基因中的一个高变区域，其在不同物种之间表现出较高的变异性，因此可以作为物种鉴定的重要分子标记。

通过特异扩增ITS区段，我们可以获取到大丽轮枝菌的核糖体基因片段，并进行后续的测序和分析。

针对大丽轮枝菌ITS区段的特异扩增，我们可以采用PCR技术。

PCR技术是一种常见的基因扩增方法，通过引物与目标基因序列的互补配对，使目标序列得以倍增。

在大丽轮枝菌ITS区段的特异扩增中，我们需要设计一对特异引物，使其与目标ITS区段的序列匹配，从而实现扩增。

同时，我们需要根据大丽轮枝菌ITS基因序列的特点，合理选择PCR反应的温度和周期，以保证扩增结果的准确性和稳定性。

在实验操作上，首先我们需要获取大丽轮枝菌的DNA样品。

可以通过提取大丽轮枝菌的菌丝体或子实体中的DNA，或者利用培养液中的菌体进行提取。

随后，我们可以选择适当的DNA提取方法，如琼脂糖酚法、配对法等，将DNA从细胞中提取出来。

提取的DNA经纯化后，可以用来进行后续的扩增实验。

在PCR反应中，我们需要准备PCR反应体系，包括模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+离子、聚合酶等。

将以上试剂按照一定比例混合均匀后，可以将混合液加入PCR管中，然后使用热循环仪进行PCR扩增。

具体的PCR温度和周期可以根据引物设计和实验要求进行调整。

扩增完毕后，我们可以通过电泳技术将扩增产物进行分离和检测。

将PCR产物与DNA分子量标准品一同进行电泳，可以根据PCR产物大小和标准品的迁移距离，确定扩增产物的大小和纯度。