病原微生物分子分型技术研究进展
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临床微生物快速检验技术研究进展目前感染性疾病是危害人类健康的重大隐患,尤其是对第三世界国家更是一严重的挑战。
随着抗生素的滥用,导致了出现大量严重的耐药菌株,加上新的病原微生物的出现,给临床诊断和治疗带来了极大的困扰。
严峻的现实给病原微生物的检测和诊断提出了更高的要求。
世界卫生组织(who)对临床微生物实验室提出:临床微生物实验室尽可能把目标集中在快速诊断方面。
传统的微生物检验法的最大弱点是慢,难以实现快速诊断与治疗,已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究。
实现更准确、更快速地检出与监测病原体成为目前临床微生物检验亟待解决的问题。
随着各种生物学技术的发展和相关学科的不断发展,特别是免疫学、生物化学、分子生物学及计算机技术的不断发展,微生物的检验速度明显加快,同时明显提高了微生物的诊断水平。
本文就对近年来微生物的快速检验技术研究进展作一综述。
1.免疫学方法在快速检测微生物抗原或抗体中的应用免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应,检测病原微生物,简化了病原微生物的鉴定步骤,备受关注。
该方法已成为一种微生物实验室常用的成熟的快速检测技术。
应用单克隆抗体结合各种形式的放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析、生物发光免疫分析等,足以检出临床标本中痕量微生物抗原,免去细菌或病毒培养过程,直接完成微生物感染的快速诊断。
如抗血清凝集技术、荧光抗体检测技术、协同凝集试验、酶联免疫测试技术等。
这些方法操作简单,已经被广泛应用于细菌的分型和鉴定,如沙门菌、霍乱弧菌、流感嗜血杆菌及隐球菌,短时间内就可完成鉴定[1]。
其中,应用酶联免疫技术制造的全自动免疫分析仪,使该技术进一步简化和准确。
许多疾病的检测都已有商品化的试剂盒出现。
2.分子生物学技术在快速检测微生物中的应用随着分子生物学技术的迅速发展,对病原微生物的鉴定已不再局限于外部形态结构及生理特性等一般检验上,而是立足于分子,特别是核酸水平的检测上,使人们对微生物的认识从外部表型逐渐转向内部基因结构特征,微生物的检测也从生化、免疫方法转向基因水平检测。
分子分型命名
分子分型(Molecular Typing)是生物学领域中的一个重要概念,它指的是通过分子生物学手段对生物样本中的分子特征进行分析,从而确定其遗传型、基因型或表型的过程。
这种分型方法广泛应用于生物学研究的各个领域,如微生物学、遗传学、病理学等。
在微生物学中,分子分型技术被用于鉴定和区分不同种类的微生物。
例如,通过PCR 扩增和测序分析,可以确定病原体的种属、毒力基因、耐药基因等关键信息,为临床诊断和治疗提供重要依据。
此外,分子分型还可以用于监测微生物的流行病学特征,分析微生物的传播途径和进化关系。
在遗传学领域,分子分型技术被用于研究生物体的遗传变异和基因结构。
通过对DNA 或RNA序列的分析,可以确定个体的基因型、基因突变、基因重组等信息,为遗传病的诊断、预防和治疗提供理论支持。
同时,分子分型还可以用于研究物种的遗传多样性和进化历史,揭示生物演化的奥秘。
在病理学领域,分子分型技术被用于研究疾病的发病机制和分子特征。
通过对病变组织的分子分型,可以确定疾病的类型、分期、预后等信息,为临床诊断和治疗提供重要参考。
此外,分子分型还可以用于研究药物的作用机制和抗药性机制,为药物研发和临床用药提供理论支持。
总之,分子分型技术是一种重要的生物学研究手段,它可以帮助我们深入了解生物体的遗传结构和分子特征,为生物学研究和临床应用提供有力支持。
随着分子生物学技术的不断发展,分子分型将会在更多领域得到应用和发展。
分子诊断技术的临床应用(一)引言概述:分子诊断技术是一种基于分子生物学原理的医学诊断方法,通过研究和分析个体的分子水平,可以提供准确、快速、个体化的诊断结果,对临床诊断和治疗起到了重要的作用。
本文将从分子诊断技术在临床应用的角度出发,分析其在五个方面的重要应用。
正文内容:一、基因突变检测:1. 遗传性疾病的诊断与预测:a. 通过检测个体基因组中的突变,可以帮助确定某些遗传性疾病的风险。
b. 分子诊断技术可以在早期阶段为家庭提供遗传咨询,帮助他们做出未来生育的决策。
2. 肿瘤突变的检测:a. 通过检测肿瘤细胞中的基因突变,可以确定肿瘤类型、预测疾病进展以及选择最合适的治疗方案。
b. 这项技术还可以监测治疗效果和肿瘤的复发情况,为个体提供个体化的治疗方案。
二、病原体检测:1. 病原体的快速鉴定:a. 利用分子诊断技术可以迅速检测并鉴定致病微生物的存在,帮助选择针对性的抗生素治疗方案。
b. 这项技术在感染性疾病的防控以及医疗资源的合理利用方面起到了重要的作用。
2. 疫情监测与溯源:a. 分子诊断技术可以在疫情爆发时,通过追溯病原体的基因序列,帮助快速定位疫情源头并制定相应的控制措施。
b. 同时,这项技术还可以为疾病传播途径的研究提供重要的参考。
三、基因表达分析:1. 疾病诊断与分型:a. 通过检测个体基因表达情况,可以辅助临床医生判断某些疾病的类型与严重程度。
b. 基因表达分析还可以帮助确定治疗对象的选择以及评估疗效。
2. 药物反应性预测:a. 基因表达分析可以识别个体对特定药物的反应差异,帮助临床医生制定个体化的用药方案。
b. 这项技术可以有效减少药物副作用,提高治疗效果。
四、循环肿瘤标志物检测:1. 肿瘤早期筛查与监测:a. 分子诊断技术可以通过血液或尿液中循环肿瘤标志物的检测,实现对肿瘤的早期筛查和监测。
b. 这项技术的应用为早期发现肿瘤提供了一种简单、无创、高效的途径。
2. 评估治疗效果与肿瘤复发监测:a. 循环肿瘤标志物检测可以帮助评估治疗效果,及早发现治疗失败。
马紫恒,赵鹏翔,马雪梅,等.布鲁氏菌病的病原学、流行病学及防治研究进展[J].江苏农业科学,2021,49(1):28-32,42.doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2021.01.005布鲁氏菌病的病原学、流行病学及防治研究进展马紫恒,赵鹏翔,马雪梅,谢 飞(北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100124) 摘要:布鲁氏菌病是世界公认的危害较为严重的人畜共患传染病之一。
由于该病防治相对困难,在我国发病形势尤为严峻。
尽管我国对于布鲁氏菌病防治采取了积极的措施,但仍然面临着巨大挑战。
因此,认清布鲁氏菌病的病原学特征、传播途径以及自然史等流行病学特征,并了解当前布鲁氏菌病的诊断、治疗以及预防现状,对于预防布鲁氏菌病的发生、减少布鲁氏菌病对农业及人类造成的健康财产损害有着重要意义。
关键词:布鲁氏菌病;病原学;流行病学;诊断;防治 中图分类号:S855.1;R183.9 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2021)01-0028-05收稿日期:2020-04-16基金项目:国家自然科学基金(编号:31500828、81602408)。
作者简介:马紫恒(1989—),男,河北承德人,硕士研究生,主要从事分子生物学检测方向研究。
E-mail:maziheng@s-sbio.com。
通信作者:马雪梅,博士,研究员,博士生导师,主要从事氢分子生物学方向研究。
E-mail:xmma@bjut.edu.cn。
布鲁氏菌病是《中华人民共和国传染病防治法》与《中华人民共和国动物防疫法》中的乙类传染病,也是世界普遍公认的危害较为严重的人畜共患病之一。
世界上有170多个国家和地区存在布鲁氏菌病的发生和流行[1],据统计全球每年约有50万布鲁氏菌病新增病例,然而此病发病早期不易与其他发热性疾病相鉴别,许多本病患者易被误诊为其他疾病,因此,该病实际的发病率要高出10~25倍[2]。
分子生物学在微生物检验中的应用南京军区福州总医院全军临床检验研究所兰小鹏21 世纪是以分子生物学为代表的生命科学的时代,近年来,随着现代生物技术的快速发展,人类基因组计划的完成,尤其是生物化学、免疫学、生物仪器及计算机理论与技术的进步,分子生物学技术在医学、遗传学、法医学、生物学等各个领域广泛应用, 新的诊断技术和方法不断涌现并被广泛应用于微生物检测,为传染病的流行病学调查、基因的多样性、微生物的生物学特性、微生物的致病性和药物的耐受性、微生物的生物降解能力等各个方面提供了重要的信息。
一.核酸杂交法最初应用于微生物检测的分子生物学技术是基因探针方法,它是用带有同位素标记或非同位素标记的DNA 或RNA 片段来检测样本中某一特定微生物核苷酸的方法。
核酸杂交有原位杂交、打点杂交、斑点杂交、Sorthern杂交、Northern杂交等,核酸分子探针又可根据它们的来源和性质分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡聚核苷酸探针等。
其原理是通过标记根据病原体核酸片段制备的探针与病原体核酸片段杂交,观察是否产生特异的杂交信号。
核酸探针技术具有特异性好、敏感性高、诊断速度快、操作较为简便等特点。
目前,已建立了多种病原体的核酸杂交检测方法,尤其是近年来发展起来的荧光原位杂交技术(FISH) 更为常用。
二.质粒DNA图谱分型技术细菌质粒分析是较早被使用的对病原微生物流行病学进行调查的分子分型技术。
这种技术包括萃取质粒DNA ,通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA。
由于不同菌株质粒DNA序列和大小不同,通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的DNA质粒图谱也将不同,因此,与流行病相关的分离株能够被分类分型。
质粒图谱分析的再现性和分辨力可通过限制性内切酶消化质粒而提高。
虽然2个不相关质粒有相同的分子量, 但性内切酶位点的位置和频率是不同的。
但质粒是可移动的非染色体遗传物质,细菌能自发的失去或很容易的获得,结果流行病相关的菌株可以展示不同质粒指纹图谱。
doi: 10.7541/2017.100鱼源无乳链球菌的血清型及分子分型研究张雨薇1耿毅1余泽辉1汪开毓1陈德芳2向正刚1李亚军1郭坤宁1牟维豪1(1. 四川农业大学动物医学院, 温江 611130; 2. 四川农业大学水产系, 温江 611130)摘要: 为了解不同鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)分子分型特征, 分析菌株之间的相关性和同源性,研究在采用S. agalactiae特异性cfb基因对分离菌株鉴定的基础上, 对26株不同鱼源S. agalactiae进行了荚膜多糖血清型(CPS)多重PCR鉴定, 同时采用多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子特征比较与同源性分析。
结果显示, 26株菌CPS型存在Ia (n=22)和III型(n=4)两种类型, 其中黄河裸裂尻鱼源和罗非鱼源菌株均为Ia血清型, 齐口裂腹鱼源菌株存在Ia (n=2)和III (n=4)型两种CPS型; 多位点序列分型共得到3种STs序列型(ST-891、ST-103、ST-19), 其中黄河裸裂尻鱼源和罗非鱼源菌株均为新的序列型ST-891, 齐口裂腹鱼源菌株存在ST-103和ST-19两种STs型; PFGE聚类分析可分为16个PFGE谱型(A-P), 其中优势带型为P型(n=9)。
相同荚膜多糖血清型—MLST分型菌株在PFGE带型中呈现高度聚集。
CPS分型与MLST分型、PFGE分型有很好的相关性, 而CPS型、STs序列型、PFGE带型与宿主的来源没有明显的相关性。
不同鱼源S.agalactiae分子特征的相似性, 提示其存在交叉感染的可能性, 而齐口裂腹鱼源S. agalactiae分子特征的多样性, 提示其存在遗传变异的情况。
关键词: 无乳链球菌; 荚膜多糖血清分型; 多位点序列分型; 脉冲场凝胶电泳中图分类号: S941.41 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2017)04-0800-07无乳链球菌(Streptococcus agalactiae), 属于链球菌科(Streptococcace), 链球菌属(Streptococcus),也称B群链球菌(Group B Streptococcus, GBS), 是兼性厌氧G+的链状球菌。
鹦鹉热嗜衣原体分子生物学检测方法的研究进展任健;柳陈坚;李海燕【摘要】@@ 鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)为鹦鹉热(Psittacosis)即鸟疫(Ornithosis)的病原体;同时,它具有广泛的感染谱,不仅能够感染130多种鸟类、数十种哺乳动物,也可以感染人引起相应的各种疾病.各种动物或人由于接触感染C.psittaci的家畜或禽鸟类的分泌物、排泄物而引起感染,该病是典型的动物源性传染病.鸟类大多呈现隐性持续感染,并且主要为个体散发,但也有群体流行爆发的病例.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2010(032)005【总页数】4页(P411-414)【作者】任健;柳陈坚;李海燕【作者单位】昆明理工大学生命科学与技术学院,云南,昆明,650224;昆明理工大学生命科学与技术学院,云南,昆明,650224;昆明理工大学生命科学与技术学院,云南,昆明,650224【正文语种】中文【中图分类】S852.61鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)为鹦鹉热(Psittacosis)即鸟疫(Ornithosis)的病原体;同时,它具有广泛的感染谱,不仅能够感染130多种鸟类、数十种哺乳动物,也可以感染人引起相应的各种疾病。
各种动物或人由于接触感染C.psittaci的家畜或禽鸟类的分泌物、排泄物而引起感染,该病是典型的动物源性传染病。
鸟类大多呈现隐性持续感染,并且主要为个体散发,但也有群体流行爆发的病例。
其临床主要表现为结膜炎、鼻炎及腹泻。
人感染发病时,主要表现为寒颤、发热、咳嗽和胸闷等非典型性肺炎的症状,此时的呼吸道分泌物具有传染性[1]。
该病在20世纪30年代初有过一次大流行,由此受到广泛关注,同时作为一种人畜共患传染病,快速准确的诊断和检测手段对于控制该病的流行显得尤为重要。
目前我国对嗜衣原体的检测主要停留在细胞培养及免疫检验阶段,与分子生物学检测方法相比,传统检测方法均表现出特异性与敏感性低,耗时长,诊断方法繁琐,确诊率低等缺陷。
分子医学与临床诊断研究一、引言分子医学是指利用分子生物学、生物化学、遗传学等现代生物学技术研究人类和动物疾病的发生、发展、诊治和预防等方面的科学。
临床诊断是指根据患者的症状、体征、实验室检查等综合分析,诊断患者是否患有某种疾病,并确定病理机制和治疗方案等。
近年来,随着分子生物学和生物化学技术的不断发展,分子医学已经成为医学研究和临床诊断领域中的一个重要分支。
本文将从分子医学、临床诊断等方面探讨分子医学与临床诊断研究的发展现状和前景。
二、分子医学与临床诊断的概述分子医学是一门跨学科的综合学科,涉及到分子生物学、生物化学、免疫学、遗传学、基因工程等多个学科的技术和理论。
分子医学可以通过研究和解析疾病的分子机制,寻找疾病的病因和发生机制,为疾病的诊治提供科学的依据和方法。
临床诊断是医生在实践工作中,通过使用多种诊断手段和技术,结合病史、病情等综合分析,对患者疾病进行鉴定和诊断的过程。
临床诊断可以帮助医生确定疾病的类型、性质、严重程度以及病情的发展和预后,并为疾病的治疗提供一定的指导和依据。
分子医学与临床诊断紧密相关,两者互为依存。
分子医学为临床诊断提供了丰富的、直接的、准确的病理数据,临床诊断则是对分子医学研究的结果进行验证和应用的实际途径。
因此,发展分子医学不仅可以提高临床诊断的准确性,还可以为疾病的治疗和预防提供更为有效和精准的手段。
三、分子医学在临床诊断中的应用1.分子诊断技术分子诊断技术是指利用分子生物学和生物化学技术对疾病的分子机制进行分析和识别,以及对疾病相关基因、蛋白质等分子标志物进行检测和鉴定的技术。
分子诊断技术可以应用于各种疾病的诊断、预测、评估和治疗等方面,并且可以提高病人的诊断准确性和治疗效果。
例如,PCR技术可以快速和准确地检测和识别各种病原微生物的DNA或RNA,在临床诊断中应用范围非常广泛;基因芯片技术可以同时检测上千种基因的表达水平,为疾病的预测、评估和治疗提供基础数据和可能性;核磁共振技术可以非侵入性地检测和分析人体内的分子成分,主要应用于心脏、肝脏、肺、肾脏等脏器病变的诊断。
分子分型及坚定-概述说明以及解释1.引言1.1 概述分子分型是一种通过研究和分类分子的结构和功能特征来理解和解释生物学和化学现象的方法。
分子分型在化学和生物学领域已经广泛应用,并为我们提供了深入了解分子的机会。
在过去的几十年中,随着先进科学技术的发展,我们对分子的认识不断增加。
分子分型通过将分子按照一定规律进行分类,可以帮助我们识别分子的相似性和差异性,从而揭示它们的结构和功能之间的关系。
分子分型具有广泛的应用领域。
在药物研发中,分子分型可以帮助科学家更好地理解药物的作用机制,并设计出更高效、更安全的药物。
在农业领域,分子分型可以用于改良作物品种,提高产量和抗病性。
在环境污染监测中,分子分型可以用于检测和识别污染物,从而保护环境和人类健康。
本文将详细介绍分子分型的意义、方法和应用。
我们将首先讨论分子分型的意义,包括它对科学研究和应用的重要性。
然后,我们将介绍不同的分子分型方法,包括结构比较、序列比对和分子建模等。
最后,我们将通过本文的阅读,读者将对分子分型有更加深入的了解,并且将了解到分子分型的未来发展方向。
这对于促进科学研究和技术创新具有重要意义,并且可以为我们解决许多现实问题提供帮助。
1.2文章结构文章结构部分可以简要介绍本文的整体结构,指出各个章节的内容和目标。
以下是一种可能的编写方式:1.2 文章结构本文主要分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分将对分子分型及坚定的概述进行说明,包括研究领域、相关背景和研究问题等内容。
同时,将介绍本文的结构和目的,为读者提供一个整体的了解和预期。
正文部分将详细介绍分子分型,包括分子分型的意义、方法和应用。
在2.1小节中,将具体解释分子分型的概念和原理,并介绍其在不同领域中的重要性。
2.2小节将重点阐述分子分型的意义,包括分子结构与功能之间的关系以及为科学研究和应用提供基础的作用。
2.3小节将介绍分子分型的方法,包括实验和计算方法,并对其进行比较和评价。
2.4小节将等方面。
传统与现代微生物分型鉴定方法与应用传统与现代微生物分型鉴定方法及其应用传统微生物分型鉴定方法:传统微生物分型鉴定方法是指使用传统的实验室技术和观察方法来对微生物进行分类和鉴定。
这些方法主要包括形态学观察、生理生化特性分析和血清学反应等。
通过观察微生物的形态特征、生长习性、代谢产物、酶活性和免疫反应等方面的差异,可以进行初步的分类和鉴定。
现代微生物分型鉴定方法:现代微生物分型鉴定方法是指利用分子生物学和遗传学等现代技术手段对微生物进行分类和鉴定。
这些方法主要包括基因测序、多态性分析、基因芯片技术和质谱技术等。
通过分析微生物的基因序列、基因表达模式和蛋白质组成等方面的差异,可以精确地鉴定微生物的种属、亚型和菌株等。
应用:微生物分型鉴定在许多领域都有广泛的应用。
以下是几个典型的应用领域:1. 医学诊断:微生物分型鉴定可以用于诊断与微生物相关的疾病,例如细菌感染、真菌感染和病毒感染等。
通过鉴定微生物的种属和亚型,可以帮助医生选择合适的治疗方案和控制传染病的传播。
2. 食品安全:微生物污染是导致食品安全问题的重要原因之一。
微生物分型鉴定可以追踪和鉴定食品中的致病菌和有害微生物,帮助监测食品安全,保障公众健康。
3. 环境监测:微生物在环境中起着重要的生态功能。
微生物分型鉴定可以用于监测水体、土壤和空气中的微生物群落结构和多样性,评估环境质量和生态系统健康状况。
4. 遗传学研究:微生物分型鉴定可以用于研究微生物的遗传多样性、进化关系和种群结构等。
通过分析微生物的遗传信息,可以深入了解微生物的演化历史和种群动态,为微生物的分类、系统发育和生态功能研究提供重要依据。
总结:传统与现代微生物分型鉴定方法在微生物分类和鉴定中起着重要作用。
传统方法主要依靠实验室观察和生理生化特性分析,而现代方法则利用分子生物学和遗传学技术对微生物进行精确鉴定。
这些方法在医学、食品安全、环境监测和遗传学研究等领域都有广泛应用。
北京出入境检验检疫局技术中心食品微生物室曾静博士2015.9微生物的发现:微生物学作为一门科学诞生于1674年。
是由充满好奇心的荷兰的布料商人Antony Van Leeuwenhoek(1632-1723)用一个经过他精心打磨的玻璃镜片去观察一滴湖水微生物学家Robert Hooke(1635-1703)成为第一个看到真菌的人。
在1665年,他发表了关于真菌的描述,他叫它们“微小的蘑菇”。
他对样本的描述非常精确,后来被确认为面包霉。
食品、化妆品等产品微生物鉴定技术在微生物检验工作中承上启下•微生物鉴定就是将微生物分类到“种”或者以下的过程;•“种”的定义:是分类系统中最基本的单位。
种经常定义为:具有杂交繁殖能力并产生后代的一大群生物有机体。
•检验检疫工作中的微生物鉴定主要是判断该种菌是不是目标的致病菌,个别时候也需要判断新发现的菌是什么菌,其中后者需要做的实验更加完善,需要多种方法的相互参考、印证才能确定。
•目前鉴定技术的发展有两个方向:一是强调速度快,可以在数十秒内实现微生物的鉴定,以时间分型质谱为代表;二是强调分型能力,以各种基于DNA的鉴定技术为代表。
•选择哪种方式,应由工作中的需要入手。
微生物鉴定技术发展历程回顾——形态•用于微生物鉴定的形态学特征:•用于微生物鉴定的生理生化反应特征:基于手工的形态学观察和生理生化反应,相对都比较繁琐,时间长,而且需要相对丰富的经验,操作无法完全标准,因而近年来被全自动微生物鉴定系统逐步替代。
——全自动•全自动微生物鉴定系统,将生化反应有效整合,并浓缩于商业化的板卡上,方便了实验室进行微生物鉴定。
•全自动生化鉴定系统的优点:•生化反应数量多,商业化的板卡最多可集合45-46种生化反应;•实验操作标准化,节省大量人工;•鉴定速度快,采用边孵育边检测的实时动态检测模式,一般3-4个小时即可出结果。
•目前,全自动微生物鉴定系统已作为实验室的日常鉴定手段。
•全球每年消耗的抗生素总量中90%被用于畜禽养殖业,耐药性微生物不可避免地产生,尤其是人畜共患病的耐药性病原菌株种类多、增长快;•耐药基因又可随细菌繁殖垂直传代,并且具有耐药因子的细菌可通过环境、饲料、肥料和食品等环节在动植物、微生物和人之间传播,进入食物链和流通环节的耐药性病原菌,将使消费者承担更大的食品安全风险;•国际上一些发达国家已集合医学卫生、食品安全和农业领域的资源,开展了“耐药性致病菌”的监测与研究工作,例如:美国NARMS 网、欧盟EARSS网、亚洲耐药性致病菌监测网ANSORP;还有许多国家正在策划对进口动物产品进行耐药性微生物的检关国家采取SPS协议措施,设置动物产品进口的限制•全自动微生物鉴定仪都具备利用微量肉汤稀释法,进行药敏实验的功能,可以在进行微生物鉴定的同时,得到微生物耐药的信息;•美国临床和实验室标准化协会(CLSI)对微量稀释法做了详细的规定,要求微量稀释法中抗生素的浓度应为倍比稀释,如2、4、8、16等浓度设置,这样测得的MIC 值(最小抑菌浓度),才能与CLSI 的规定的抗生素折点、耐药/中介/敏感(S/I/R )等结果进行比较。
结核分支杆菌复合群 DNA 分型研究进展程广宇;刘春法;崔永勇;周洋;赵德明;周向梅【摘要】Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC)has enormous impact on human society world widely as a zoonotic pathogen,including M.tuberculosis,M.bovis and the other clusters.Although the nu-cleotide similarity of MTBC is beyond 99.9%,several molecular biological techniques are developed for ge-netic typing so far,such as spoligotyping and MIRU-VNTR analysis.Among them,methods based on the whole genome sequence data are the most reliable.With the development of DNA sequencing in five years, the whole genome sequence data of MTBC accumulate while more analysis methods based on the whole ge-nome sequence data appear.This paper synthesized the genomic typing methods and put forward prospect. We can further study gene function and host immune recognition,which will benefit for understanding the pathogenesis of tuberculosis and making reliable prevention and controlprogram.%1882年首次分离到结核分支杆菌病原体以来,已知结核分支杆菌复合群(MTBC)包括人结核分支杆菌、牛分支杆菌、非洲分支杆菌、田鼠分支杆菌等,是在全球范围内具有重要影响的人兽共患病病原体,但近年对它们的研究还远远不够。
病原微生物分子分型技术研究进展现代分子分型技术主要包括质粒DNA图谱分析、限制性内切酶消化后的染色体DNA分析、核酸探针杂交、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、PCR和多位点序列分析(MLST)技术。DNA重复序列PCR技术(Rep-PCR)的实用性强、低用费、可再现性好,可用来进行普查工作。PFGE技术分辨力高,是病原微生物分子分型的最佳选择。而有更高分辨力和再现力的MLST新技术正在逐渐被使用。这些分子分型技术将有助于在全球范围内进行病原微生物流行病学研究。本文对近年来常用的病原微生物分子分型技术的研究进展作一综述。
一.评估分型技术标准的可行性 评估一项分型技术是否可行的标准有2个:完成标准(有效性)和便利标准(效率性)。完成标准包括分型能力、分辨力和分型技术间的一致性,而便利标准包括通用性、快捷性、解释和执行的容易程度。一项分型技术的分型能力意味着通过这项分型技术,分离株被划分为所属类型的比例。再现性是指通过这种技术对同种样品在重复检测时,产生相同结果的能力。分辨力是指拥有一致的或非常相似的相关图谱的分离株事实上具有相同的传播途径的可能性。2种分型技术的一致性通过使用这些技术把高度相似的分类株分组归类而被评价〔1,2〕。因此,对一种分型技术来说首选标准是有效性〔3〕。当应用于细菌病原菌时,一种分型技术必须要有效率性优点。通用性就是用于任何病原菌的能力,这对于医源性病原菌感染的研究是一个非常重要的优点。操作和解释结果的容易度以及所需费用、试剂和仪器的可行性都是选择一项分型技术的重要标准〔2-4〕。
二.现代分子分型技术 1.质粒DNA图谱分型技术 细菌质粒分析是较早被使用的对病原微生物流行病学进行调查的分子分型技术〔4〕。这种技术包括萃取质粒DNA,通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA。这是一种容易操作和理解的技术。由于不同菌株质粒DNA序列和大小不同,通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的DNA质粒图谱也将不同,因此,与流行病相关的分离株能够被分类分型。质粒图谱分析的再现性和分辨力可通过限制性内切酶消化质粒而提高。支持这个方案的理论是,虽然2个不相关质粒有相同的分子量,限制性内切酶位点的位置和频率是不同的。但此技术也有应用局限,质粒是可移动的非染色体遗传物质,细菌能自发的失去或很容易的获得,结果流行病相关的菌株可以展示不同质粒指纹图谱。许多质粒带有抗性决定因子的基因,存在于转位子上,而转位子很容易丢失或获得,这同样可以迅速改变质粒DNA组成。产生图谱的再现性也会由于质粒空间存在的不一致性(超螺旋的、断口的和线形的)而被影响,而凝胶电泳时具有不同迁移速度。大多数病原微生物有质粒,但没有质粒的就不能用此技术分型。此外,由于有些分离株中含有1个或2个质粒,会使菌株间的分辨力降低〔4〕。 2.染色体DNA限制性内切酶分析技术 染色体DNA经限制性核酸内切酶消化,消化后的片段再通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。用限制性内切核酸酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因组DNA,因为它们对染色体上的酶切位点非常敏感,可以产生大量短的片段。电泳后,将获得一系列被分离的DNA图谱。通过比较图谱,就可以进行菌相似性研究。几乎所有的病原微生物分离株都可以通过这种方法分型,但由于基因组DNA巨大,酶切后产生的片段众多,且含有大量的重叠片段,这将导致菌株间图谱一致性分析产生困难〔4〕。 3.核酸探针杂交技术 用高效率的限制性内切核酸酶消化染色体DNA后,染色体就被分解成一系列不同大小的片段,具有一定的片段长度多态性。由于片段太多(包括上述的重叠片段),给分型带来困难。这种分型困难可以通过印迹杂交解决。有报道,以印迹法为基础的针对金黄色葡萄球菌进行分型研究的2次分型法〔4〕,首先是通过金黄色葡萄球菌染色体DNA随机扩增而制备一些探针,再使用几株菌检验探针的特异性,并选择出有效的探针。使用2次筛选到的探针与分离株进行杂交,根据是否杂交,对分离株进行分型,效果良好。 4.染色体DNA的脉冲场凝胶电泳分型技术 PFGE分型技术是〔5〕使用对染色体有很少酶切位点的限制性核酸内切酶消化细菌DNA,产生大的DNA片段(10~800kb),这些大片段不能通过常规电泳方法进行有效分离。在电场方向周期改变(脉冲)的凝胶电泳条件下,DNA片段根据大小有效分离。PFGE产生的染色体DNA图谱比用那些高频率切割的限制性内切酶产生的图谱更为简单清晰〔6〕。理论上,所有的细菌都能使用PFGE进行分型分类,结果具有极高的再现性和分辨率,鉴于PFGE技术的一系列优点,一些人把其视为一种理想的分型技术,并推荐作为对金黄色葡萄球菌等病原微生物分型的最优标准技术〔4〕。使用PFGE也有一些局限,例如所需时间长,使用的试剂非常昂贵,要求专门的仪器等。另外,很小的电泳条件的不同就可以改变每条光谱带间距离,使用不同凝胶进行电泳得到的结果也比较复杂,这为不同实验室间的结果比较带来一定麻烦〔7〕 5.聚合酶链反应技术 聚合酶链反应(PCR)是一种高灵敏度的体外扩增DNA片段的技术,近年来在病原微生物分型研究上也得到了广泛应用。而且,科学家根据微生物基因组特点及分型工作的需要,对PCR技术进行了一系列的改良,使其成为了快速、简捷的分型技术。目前,常用的PCR分型技术有随机扩增的多态性DNA技术(RAPD)和重复序列PCR技术(Rep-PCR)。RAPD是一种典型PCR衍生技术,用一系列任意的核苷酶序列(10个碱基)作为引物,通过引物与模板DNA序列随机配对进行PCR扩增。由于引物较短,所以退火温度要求较低。扩增时只有距离最近、方向相反的2个引物之间的模板DNA区段才能被扩增。因此,基因组在这些区段如发生了DNA片段缺失、插入或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化。通过电泳对扩增产物DNA片段的多态性进行检测、分析就可以反应出不同菌株基因组的DNA特点,从而对他们进行分型。RAPD技术的使用范围也非常广,分辨结果也有较好的实验室再现性。与其他技术相比,这种技术的优势是它的简便性和快捷性。分辨力依靠引物的数据和核苷酸序列而改变。使用单引物具有低分辨力,但是使用3个或3个以上引物时,会使获得最终结果所需时间大大减少〔8,9〕。虽然RAPD的分型结果在不同实验室间变化较大,分辨力不如PFGE技术,但在疾病暴发流行时,PAPD仍是一种分析相关菌株和排除不相关菌株的良好技术〔10〕。Rep-PCR技术是利用细菌基因组中广泛分布的短重复序列为引物靶序列,进行PCR扩增,通过对PCR产物电泳结果的比较,分析菌株间基因组存在的差异〔11〕。这些重复序列在原核生物界广泛存在,这一些细菌属和种中是保守的。在这种方式获得的图谱中,光谱带的大小和数量的不同代表着不同菌株重复序列间的距离和重复序列的数量,该技术对于大量或少量的菌株分型均适用,简单易行。与其他分类技术相比,这种技术有更高的分辨力。研究表明,虽然有时Rep-PCR分辨力稍低,但与PFGE获得的结果确有很好的关联度。最近已经有人把Rep-PCR与其他已经用于菌株分类的基因分型技术相比较。分析结果显示,Rep-PCR与RAPD和PFGE有相同的分辨力〔12〕。与RAPD相比,Rep-PCR在DNA提纯中需要一额外步聚。因此,RAPD技术比Rep-PCR稍微简单快速。然而Rep-PCR技术的再现性非常好,这是RAPD无法比拟的。与PFGE相比,Rep-PCR主要的优点是操作中简便和快捷。而再现性PFGE相似。 6.多位点序列分型技术 多位点序列分型技术(MLST)源于多位点酶凝胶电泳技术(MLEE)〔12〕,MLEE属于表型分型技术,涉及到能进行选择性染色的蛋白电泳技术。首先,把要研究的蛋白质从生物体中萃取出来,用电泳分离,随后选择性的染色。根据迁移率,每条光谱带都反应了相应的蛋白质基因类型。不同位置相同蛋白质的2条光谱带反应出2种不同构象的不同蛋白质,因此,是同一个基因的等位基因。MLEE有一个明显的缺点即特殊位点的碱基序列不能直接的通过分析这个位点的表达产物而推断。因为2个不同基因序列可以表达具有相同迁移率的2种蛋白质,它们将会在MLEE中被检测为同1条带。MLST技术解决了这个问题。使用MLST技术,不分析基因的表达产物,而是分析基因的核苷酸序列。1个基因突变后,形成不同的核苷酸序列,将明确被认定为是这个基因的等位基因。使用MLST技术时,对于每个菌株都要选择一定的核甘酸位点,这些位点通常位于持家基因内部片段之内,片段长度约500bp序列。选择持家基因是由于在待测菌株中,它们通常肯定存在,并有足够的变异度来适合在这些位点产生变异的等位基因的存在。已经有人使用PFGE方法证实了MLST技术对金黄色葡萄球菌分型的有效性。他们发现用MLST技术分为1组的各个菌株具有相似的PFGE图谱,相反用MLST技术得到的不同菌株具有显著不同的PFGE图谱〔5〕。MLST的绝对分辨能力可超过20×109个等位基因图谱。通过等位基因图谱定义的菌株类型由不多于7个的1串数字组成,这种信息是清晰的并且很容易在全球通过电子媒介传达。而且,那些难以计数的图株类型的等位基因图谱可以通过互联网很容易的被商议和统一,从而使全球的流行病学数据标准化〔13〕。MLST的缺点是它的高额费用和操作过程所需的特定仪器。这使得这项技术只能局限在大型的全球性流行病学研究中心使用,影响其在医院推广普及。
三.小结 虽然标准的解释Rep-PCR图谱的要点还没有最终确定,但是它具有的高分辨力、简单易行和良好的可再现性等特点,还是决定了它在目前以及今后一定时间内是最佳的病原微生物分子分型技术,尤其在缺乏专业仪器设备的实验室(如不能进行PFGE技术和DNA测序工作的实验室),以及疾病暴发流行的谱查阶段,它将是首选的技术。PFGE技术虽然耗时长、技术复杂,但确是一种能获得最佳分型结果的技术,有效地强化它的再现性。由于它所使用的仪器相对便宜,PFGE的使用将会普及,并被用来解决其他简单分型遗留的不足。长期以来,找到一种有足够分辨力的技术区分与流行病相关的菌株是一项技术难题。解决这个难题的方法是在一项研究中使用一种以上技术,一种技术的缺点会被其他技术的优点所代替。分子分型技术对于病原微生物分型是非常有价值的手段,将得到更加广泛的推广使用。
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