鼠源单克隆抗体制备通用技术要求

鼠源单克隆抗体制备通用技术要求 General technical requirements for preparation of mouse monoclonal antibody I

目 次 前言 ................................................................................ II1 范围 .............................................................................. 12 规范性引用文件 .................................................................... 13 术语和定义 ........................................................................ 14 技术要求 .......................................................................... 15 人员要求 .......................................................................... 46 设施设备与生产环境 ................................................................ 57 生产和质量控制 .................................................................... 58 抗体制品的检验要求 ................................................................ 71

鼠源单克隆抗体制备通用技术要求 1 范围 本文件规定了鼠源单克隆抗体（以下简称“鼠单抗”）制备的技术要求、人员要求、设施设备与生产环境、生产和质量控制、抗体制品的检验要求。 本文件适用于鼠源单克隆抗体制品的生产。

2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过对文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 14925 实验动物环境及设施 GB/T 25915.1-2010 洁净室及相关受控环境 第1部分空气洁净度等级 GB 51110 洁净厂房施工及质量验收规范

3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 骨髓瘤细胞 B-淋巴浆细胞系统恶性增殖所致一种肿瘤。3.2 抗原 能诱导机体发生免疫应答的物质。 3.3 杂交瘤细胞 用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞。3.4 饲养细胞 帮助其它活的细胞在体外细胞培养中生存与繁殖的细胞。 3.5 腹水 将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于BALB/C小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含有单抗的腹腔积液。

4 技术要求 4.1 制备流程 4.1.1 鼠单抗制备流程见图1。 4.1.2 图1中骨髓瘤细胞培养、骨髓瘤细胞筛选、细胞融合、HAT选择性培养的制备过程应在洁净室内完成。 4.1.3 4.1.2条中的洁净室空气洁净度等级应符合GB/T 25915.1-2010中ISO7级的要求。

图1 鼠单抗制备流程图 三免疫小讯

计髓瘤细心进入三廿问瘤细胞

三脾细抱悬液杂交摺细胞

不合格廿问摺细胞

；合格母克唔细胞

怍母克性细胞三

单克陛细胞株小合恪单克湟细袍株阳忤单克隆细／且株三

含有相应抗体的腹水／培养上沾纯化杭体．不合格纯化抗体仓格纯化抗体4.2 4.2.1 4.2.1.1 4.2.1.1.1 4.2.1.1.1.1 BALB/C

4.2.1.1.1.2 a)b)

4.2.1.1.2

4.2.1.1.3 4.2.1.1.3.1 4.2.1.1.3.2 3 4.2.1.1.3.3

4.2.1.2

4.2.1.2.1 4.2.1.2.2 4.2.1.2.2.1 4.2.1.2.2.2 4.2.11

4.2.2 4.2.2.1 11015 4.2.2.2 4.2.2.3 10%HAT 4.2.2.4 100l96375%CO2

4.2.3 HAT 4.2.3.1 HAT10

4.2.3.2 HAT35 4.2.4

过程要求细胞融合前准备脾细胞悬液准备小鼠免疫应选用检疫合格的纯种““小鼠，在细胞融合前两个月左右选择合适的免疫方案对小鼠进行免疫。小鼠免疫方案按抗原性质分为：可溶性抗原免疫方案；颗粒抗原免疫方案。

免疫小鼠检测小鼠免疫后应进行免疫小鼠血清滴度测定检测。脾细胞悬液准备应使用血清滴度测定检测合格的免疫小鼠进行脾细胞悬液准备。应在免疫小鼠加强免疫天后将小鼠拉颈处死。应在无菌环境下获取免疫小鼠脾脏制备成脾淋巴细胞悬液。

骨髓瘤细胞培养采用的骨髓瘤细胞应和免疫动物（小鼠）属千同一品系。骨髓瘤细胞准备应选取对数生长骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞筛选融合前应对骨髓瘤细胞进行筛选，确保无细菌、霉菌及支原体污染时方可用千细胞融合。经筛选后残留有不符合要求细胞的培养皿应按条的要求进行处理。

细胞融合准备好的骨髓瘤细胞和脾细胞悬液应按：~: 的比例进行混合。混合后的细胞应弃净上清。弃净上清后，应用含小牛血清选择培养液重悬。混合后的细胞应按每孔µ 的剂晕，加入到已有饲养细胞层的孔培养板中，置千oc、培养箱中进行培养。

选择性培养融合后的细胞，应在选择培养液中进行培养。当培养天左右，应根据细胞密度，进行杂交瘤细胞筛选。选择培养期间应在融合后天～天更换一半培养液。

杂交瘤细胞筛选4.2.4.1 4.2.4.2 4.2.11 4.2.5 4.2.5.1 96 4.2.5.2 100%3

4.2.6

4.2.7 / 4.2.7.1 1026BALB/C” 4.2.7.2 0.2ml 4.2.7.3 4.2.7.4 /

4.2.8 4.2.8.1 4.2.8.2 DNA 4.2.8.3 /

4.2.9

4.2.10 4.2.11 4.2.12 7.2.7

5 5.1 5.1.1

应以快速、简便、特异、敏感为原则，根据抗原的性质、抗体的类型，选择不同的筛选方法，筛选出阳性母克隆细胞。经筛选后残留有不符合要求细胞的培养皿应按条的要求进行处理。

单克隆化应在克隆前一天按要求准备已有饲养细胞层的孔培养板。连续克隆化后抗体阳性率达，经体外连续传代个月以上和反复冻存、复苏，细胞系能保持稳定分泌特异性抗体。

单克隆细胞株筛选应按要求对阳性单克隆细胞株进行筛选后，用合格的阳性单克隆细胞株抗体进行腹水的大量生产或培养上清的收集。

腹水生产培养上清收集应挑选周龄至周龄的健康纯种“小鼠，进行腹水的大量生产。腹水收集完后，应观测杂交瘤细胞在腹水中的含量，并留样，备腹水滴度测定用。应将过度生长的杂交瘤细胞培养上清，收集千无菌离心管中，离心弃沉淀，收集上清。所有保存腹水和上清的收集管上应写明项目名称、克隆号、腹水上清数量、生产日期等。

单克隆抗体纯化应尽可能选用不引起免疫球蛋白聚合、变性等的纯化方法及条件。应验证所用的纯化方法能去除可能存在的非目标产物污染，如不需要的免疫球蛋白分子、宿主、用千生产腹水抗体的刺激物、内毒素、其它热原质、培养液成分或层析柱析出成分等。应验证所用的纯化方法能有效的去除灭活病毒。

纯化抗体鉴定应对生产的各批纯化抗体进行鉴定，各批产品之间应具有良好的重复性。鉴定合格的纯化抗体才能入库。

纯化抗体入库鉴定合格的纯化抗体应按要求进行标识后方可入库。培养皿处理培养皿使用后应统一交予具有相关资质的第三方进行回收处理。小鼠处理应符合的要求。

人员要求资质要求操作人员应具备基本的专业知识，并接受特定的专业技术培训后方可上岗。5.1.2 5.1.3 5.1.4

5.2 5.2.1

5.2.2 5.2.3 5.2.4

6 6.1 6.1.1

6.1.2 6.1.3 GB 51110 6.1.4 6.1.5 6.2 6.2.1 6.2.2 GB 19489-2008 6.2.3 GB 14925 6.2.4

6.2.5 6.3 6.3.1 CO2

6.3.2 6.3.3

6.3.4 6.3.5 6.3.6

细胞制备技术人员应身体健康无传染性疾病，能熟练掌握无菌操作技能，并具备细胞培养经验，其职称、学历、经历、资格证书、继续教育与健康记录，应建档保存。动物实验人员应经过培训，取得上岗证，实行持证上岗。企业应当配备鼠源单克隆抗体制品相应专业知识的生产及质量管理人员和技术人员。

工作要求任何进入生产区的人员均应当按照规定更衣。工作服的选材、式样及穿戴方式应当与所从事的工作和空气洁净度级别要求相适应。操作人员应当避免裸手直接接触实验器材和设备表面。生产用设备、材料等物品进入洁净室，应在洁净室外除去外包装，并进行除尘处理。工作时应按要求做好各项试验参数和工作记录。

设施设备与生产环境生产环境鼠单抗生产企业应有整洁的生产环境，厂区的地面、路面及运输等不应对抗体的生产造成污染，生产、行政、生活和辅助区的总体布局应合理，不得互相妨碍。厂房应按生产工艺流程及所要求的空气洁净级别进行合理布局。同一厂房内及相邻厂房之间的生产操作不得互相妨碍。在设计和建设厂房时，应考虑使用时便千进行清洁工作。洁净室的设计和建设应符合的要求。洁净室的内表面应平整光滑、无裂缝、接口严密、无颗粒物脱落，并能耐受和消毒，墙壁与地面交界处宜成弧形或采取其它措施，以减少灰尘聚集和便千清洁。应根据生产要求的洁净度划分实验区域。

设施厂房应有防止昆虫和其它动物进入的设施和应急照明设施。实验室生物安全防护应符合中的一级防护水平要求。实验动物房应与其它区域严格分开，其设计建造应符合的要求。实验动物场所为单独区域，与办公和其它实验场所应分开。且应设置安全出口、出口指示、灭火器，配置应急洗眼器。洁净室应根据生产要求提供足够的照明。

设备主要仪器、设备有无菌工作台、离心机、培养箱、纯水装置、高压蒸汽灭菌器、显微镜、超低温冰箱、液氮生物容器、电泳仪、酶标仪、流式细胞仪等。关键设备应经过确认，符合要求后方可用千生产。设备的设计、选型、安装、改造和维护必须符合预定用途，应当尽可能降低产生污染、交叉污染、混淆和差错的风险，便千操作、清洁、维护，以及必要时进行的消毒或灭菌。应当建立设备使用、清洁、维护和维修的操作规程，并保存相应的操作记录。应当建立并保存设备采购、安装、确认的文件和记录。所有计戴器具和设备应定期进行计量和校准。