一种黄病毒引起鸭产蛋下降的诊断报告

一种黄病毒引起鸭产蛋下降的诊断报告
摘要:2010年以来湖北省部分地区蛋鸭群出现了严重的产蛋下降以及持续性死亡,对发病鸭进行了病理剖检以及病毒的PCR鉴定｡其中用RT-PCR检测鸭黄病毒为阳性,禽流感病毒､新城疫病毒和减蛋综合征病毒均为阴性｡对PCR扩增的鸭黄病毒目的片段进行回收测序,将测序结果与黄病毒属的7个不同的病毒群进行序列比对,表明该病毒与黄病毒科黄病毒属恩塔亚病毒群的坦布苏病毒THCAr株和sitiawan株同源性较高,分别为89.3%和87.1%,具有较近的遗传进化关系｡
关键词:蛋鸭;产蛋下降;鸭黄病毒;RT-PCR;序列分析
The Diagnosis of a Flavivirus Causing Duck Egg Drops
Abstract: A disease causing severe egg drop and duck death was observed at many breeder duck farms in Hubei province since 2010. The samples showed positive to flavivirus, but negative to avian influenza virus, Newcastle disease virus and egg-drop syndrome virus by RT-PCR detection. The Sequence analysis based on the amplified flavivirus gene revealed that the strain was closely related to strain THCAr and sitiawan which submited to Ntaya virus group of Flavivirus genus in Flaviviridae family, and the identity was 89.3% and 87.1%, respectively.
Key words: laying ducks; decrease of egg laying; duck flavivirus; RT-PCR; sequence analysis
2010年以来湖北省部分地区大型养鸭场饲养的种鸭和蛋鸭出现了严重的产蛋下降,其中有 6 000多只蛋鸭出现不同程度的发病,产蛋率从90%~95%下降到40%~45%,并且死亡三四百只,死亡率达到6%左右,造成了巨大的经济损失｡临床剖检可见其卵巢严重充血､出血;肺脏有肉变,并有很多白色圆形小结节;脾脏充血肿大,而腺胃､肌胃及其交界处没有出血点,较正常｡对发病鸭进行了相关病毒的病原学检测,检测出鸭黄病毒阳性｡根据临床剖检情况,发病鸭卵巢充血､出血严重,并且从鸭病变的卵巢样品中扩增出阳性病毒,因此暂将该病毒命名为鸭出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic ovaritis virus,DHOV),现将相关研究结果报道如下,为兽医工作者临床诊断此病提供一定的依据｡
1材料与主要试剂
1.1材料
发病种蛋鸭的肺脏､脑､输卵管､卵泡等组织｡
1.2主要试剂
Tryptic Soy Agar (TSA)固体培养基,购自DifcoTM公司,按说明书配制后使用前加入新生牛血清至终浓度为10%;AMV反转录酶(Progema)､RNA酶抑制剂(Progema)､DEPC(Sigma)､dNTPs购自宝生物工程(大连)有限公司;Trans 2k plus DNA Marker购于北京全式金生物科技有限公司;Viral RNA Mini Kit购自上海华舜生物技术有限公司;Agarose Gel DNA Extraction Kit购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司氯仿等试剂为分析纯试剂｡
2试验方法
2.1细菌分离
无菌采取病(死)蛋鸭的肝脏､心血和脑组织,接种TSA固体平板､普通营养琼脂和麦康凯琼脂等培养基,置37 ℃温箱培养过夜｡
2.2引物设计和合成
参照Tembusu virus NS5 基因序列设计了两对引物｡第一对引物为上游引物DFV-U1:5′-AGAGCGATCTGGTACATGTGGCTAG-3′,下游引物DFV-D1:5′-GATAAGCTGGACGCACAGATTCG-3′,目的片段为450bp｡第二对引物为上游引物DFV-U2:5′-TGCTCTCAACACTTTCACGAATCTG-3′,下游引物DFV-D2:5′-GCAGCTCATGGAAATGGTGTGAAC-3′,目的片段为335 bp｡由上海生工生物工程有限公司合成｡
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引物的合成参考国家农业行业标准[1]､新城疫病毒(New castle disease virus,NDV)､减蛋综合征病毒(Egg drop syndrome virus,EDSV)的特异性引物由本实验室设计并合成保存｡
2.3病毒RNA的提取
将卵巢､肺､脑等病变组织剪碎,加生理盐水研磨后冻融3次,10 000 r/min离心5 min,取上清250 μL,根据RNA提取试剂盒说明书提取病毒全基因组RNA｡病毒RNA样品用30 μL的DEPC水溶解｡
2.4一步法RT-PCR及产物纯化
取5 μL RNA作为模板进行黄病毒的RT-PCR扩增｡RT-PCR反应体系为:5 μL 10×buffer(含Mg2+),1 μL dNTPs,1 μL上游引物,1 μL下游引物,1 μL 模板,0.5 μL Taq酶,0.5 μL M-MLV酶,10.0 μL H2O;RT-PCR反应条件为:42 ℃ 30 min,95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,33个循环;72 ℃ 10 min｡PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳｡电泳完成后切下目的片段,用Agarose Gel DNA Extraction Kit纯化回收DNA｡同时利用AIV､NDV､EDSV的特异性引物进行PCR扩增｡
2.5测序与序列分析
扩增出的目的基因片段回收,送往北京英骏公司测序｡测序结果用BLAST(/BLAST)在线进行同源搜索｡核酸和氨基酸分别用DNAstar软件中的MegAlign程序的Clustal W运算,结果用GeneDoc2.6(/biomed/genedoc/)进行遗传进化分析,分析所用病毒及其GenBank登录号见表1｡
3结果
3.1细菌分离结果
无菌条件下取病鸭的心血､脑等组织,37 ℃恒温培养24~48 h后,未见透明､圆形的菌落,几个大菌落经涂片染色镜检观察,为常见大肠杆菌｡
3.2PCR检测结果
组织样品有10份,用两对不同的引物对样品提取的RNA进行扩增,从图片可以清晰地看到样品3和样品4均出现了目的条带,目的条带较大的为第一对引物扩增,约450 bp(图1左),目的条带较小的为第二对引物扩增,约330 bp(图1右)｡将测出的阳性样品3进行大量扩增,扩增出约450 bp的目的条带(图2),电泳完成后切下目的片段,用Agarose Gel DNA Extraction Kit纯化回收DNA｡
同时用AIV､NDV､EDSV的特异性引物进行RT-PCR扩增,其结果均为阴性,未见扩增出目的条带｡
3.3同源性分析和进化分析
将测序的结果经BLAST分析表明,扩增的序列属于黄病毒的NS5基因｡因此,检测出的病料中应该含有一种黄病毒｡从黄病毒属的7个不同的病毒群中选取已知NS5序列的病毒进行序列同源性分析和进化分析｡用DNAstar的CLUSTALW 分析显示,该株病毒DHOV与strain sitiawan和strain THCAr同源性最高,分别为87.1%和89.3%,用扩增的NS5序列构建的进化树(图3)所示,DHOV与strain sitiawan和strain THCAr位于同一个小的分支,具有相近的遗传进化关系｡由此推断该毒株应该同属于黄病毒属的恩塔亚病毒群｡
4讨论
黄病毒科黄病毒属由超过70种病毒组成[2],分为蜱传病毒､蚊媒病毒和节肢动物媒介未知的病毒｡蚊媒病毒类又分为Aroa病毒群(Aroa virus group)､登革热病毒群(Dengue virus group,DEV群)､JEV群､科科贝拉病毒群(Kokobera virus group)､恩塔亚病毒群(Ntaya virus group,NTA V群)､斯宠德温尼病毒群(Spondeweni virus group)和黄热病病毒群(Yellow fever virus group,YFV群)[3]｡近年来,黄病毒分布越来越广,可能与全球变暖有一定的关系[4,5]｡
在我国,主要的黄病毒为流行性乙型脑炎病毒､森林脑炎病毒和登革热病毒[6]｡自2010年以来,我国上海､浙江和江苏等地均出现了鸭黄病毒感染的事件[7]｡在湖北省一些养鸭场也出现不明原因的产蛋下降,临床表现为产蛋严重下降甚至停止,并有一定的致死率,剖检病鸭脾脏呈现明显肿大,卵巢肉变,卵泡严重充血､出血｡
在本试验中用采集的组织样品肺､脑､病变的输卵管和出血的卵泡进行基因组的提取,从检测结果初步分析,病变的卵泡检测出鸭黄病毒阳性,而肺､脑及输卵管均未检测出阳性,这除了与本试验建立的检测方法的敏感性有关外,应与该病毒的含量也有关系,这为临床样品的采集和检测提供了一定依据｡而该株黄病毒的组织嗜性还有待在进一步的动物回归试验中进行系统研究｡本研究检测出的黄病毒,对扩增出的产物序列进行同源性分析和进化分析的结果表明,该株病毒与黄病毒科黄病毒属蚊媒病毒类的恩塔亚病毒群的Tembusu virus strain THCAr和Tembusu virus strain sitiawan具有相近的遗传进化关系,应该也属于恩塔亚病毒群,但亦存在明显的遗传距离｡因此,该病毒可能是黄病毒属的一个新成员｡目前本实验室正在开展该病毒分离及其生物学特性方面的研究｡
参考文献:
[1] NYT 772-2004. 禽流感病毒RT-PCR试验方法[S]. 北京:中国农业出版社,2004.
[2] KUNO G, CHANG G J J, TSUCHIYA K R, et al. Phylogeny of the genus Flavivirus[J]. Journal of Virology, 1998,72(1):73-83.
[3] FAUQUET C M, MAYO M A, MANILOF J, et al. Virus Taxonomy. Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses[M]. USA: Elsevier Academic Press,2005.981-998.
[4] GAUNT M W, SALL A A, DE LANBALLERIE X, et al. Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their epidemiology, disease association and biogeography [J]. J Gen Virol,2001,82(Pt8):1867-1876.
[5] GOULD E A, MOSS S R, TUMER S L. Evolution and dispersal of encephalitic flaviviruses[J].Arch Virol Suppl,2004(18):65-84.
[6] 腾巧泱,颜丕熙,张旭,等. 一种新的黄病毒导致蛋鸭产蛋下降及死亡[J]. 中国动物传染病学报,2010,18(6):1-4.
[7] 曹贞贞,张存,黄瑜,等. 鸭出血性卵巢炎的初步研究[J]. 中国兽医杂志,2010,46(12):3-6.。