第三章 细胞破碎

第三章细胞破碎

1.细胞破碎技术:

细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。

2.细胞破碎方式：

3.细胞破碎方法及其原理：

4.在选择细胞破碎方法时需要考虑哪些因素？

a) 对象的细胞结构—不同结构的细胞破碎方法的不同

b) 破碎细胞过程中,对目的物的破坏程度

c) 提取物需要的保护条件

d) 破碎温度

5.几种常见破碎细胞的机械法：

a) 高压匀浆破碎法（homogenization）

b) 高速珠研磨破碎法（bead grinding）

c)

超声波破碎法（ultrasonication）

高压匀浆法：采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）；细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。

☆高压匀浆法适用的范围：

➢酵母和大多数细菌细胞的破碎；➢料液细胞浓度可以很高，20%左右。

☆不宜使用高压匀浆法。 ➢易造成堵塞的团状或丝状真菌 ➢较小的革兰氏阳性菌

➢含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀

浆阀）

影响高压匀浆器细胞破碎因素：

 升高压力有利于破碎，

✓减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几

乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。

✓但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p

超过一定值时，R增加但很慢。

✓在工业生产中，通常采用的压力为55－70Mpa。

 破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同

大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，

生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基

上容易破碎。

珠磨法 bead mill：细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细破碎，释放出内含物。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机。

珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。

超声波破碎：超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。

超声波破碎的机理：一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。

超声波破碎的适用范围： 6. 不同机械破碎方法的比较：

➢超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数

微生物的破碎。

➢一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易

破碎，对酵母菌的效果较差。

➢但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性

活性物质失活。

➢超声波破碎的有效能量利用率极低

➢由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，

但在实验室小规模细胞破碎中常用

7.非机械破碎方法

酶溶破碎法（enzyme lysis）化学破碎法（chemical treatment）去垢剂破碎法（detergents）

渗透压冲击破碎法（osmotic shock）冻融破碎法（freezing and thawing）

a) 酶解b）化学法溶胞c)物理法–渗透压冲击–冻结和融化–干燥法

其中酶法和化学法溶胞应用最广。

8.酶解（酶溶法Enymaticlysis) 酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。

a）外加酶法

9.化学渗透法（Chemical permeation）

某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。

该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。

10．细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；。非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。

无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解

11.化学渗透法中有机溶剂的作用；能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等

EDTA螯合剂作用；处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。 G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。

12.

13.选择破碎方法的依据：

a)细胞处理量；

b)细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种

类和壁厚度)；

 c)目标产物对破碎条件的敏感性；

d)破碎程度；

 e)目标产物的选择性释放

14.基因工程菌培养液不同表达形式的前处理:

胞外分泌型表达：离心,收集液相→浓缩→纯化。

胞内表达：

胞内可溶性表达：离心,收集菌体→细胞破碎→离心，收集上清→纯化

胞内周质表达：离心,收集菌体→低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物→离心,收集上清液→纯化。

不溶性包涵体：离心,收集菌体→细胞破碎→离心,收集沉淀→包涵体洗涤→目标蛋白变性溶解→复性→纯化。

15.包含体的构成:



16.基因工程包涵体的纯化方法:

包含体的出现不仅增加了

生物分离设计的难度，也

为蛋白质折叠机理研究提

出了新的课题。 欲获得天然活性态的目标

产物，必需分离包含体后，

溶解包含体并使其中的目

标蛋白恢复应有的天然活

性。

17.包涵体获得几种常见的工艺路线:

路线1特点:是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，

获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。

优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒

素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个

角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。

缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，

加工时间较长。

18．路线2 的特点：路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。

优点是封闭式操作，不污染环境也不受

环境污染，能量消耗也比离心法少。



缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，

难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常

常导致可溶性蛋白质的滞留。

19．路线三：用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎

又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，

节省了设备和时间，比前两者更适合于实

验室操作。

缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混

杂在产物中间，给后续分离带来困难。

20．包涵体的洗涤：

21.目标蛋白的变性溶解：

包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。

常用变性剂：

▲ 5-8 mol/L盐酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破坏离子间相互作用；

▲表面活性剂如1-2％ SDS，

作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。

▲ PH>9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。

影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和

浓度。

22．目标蛋白的复性：

原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。

复性方法：a)稀释法除变性剂－加入大量水或缓冲液。

b)膜分离法除变性剂－透析、超滤、电渗析。

c)层析法：凝胶层析，高效疏水层析

23.