SV40Tag基因片段转染SD大鼠牙囊细胞后相关生物学特性初步研究

SV40Tag基因片段转染SD大鼠牙囊细胞后相关生物学特性初步研究

[摘要] 目的 转染猿肾病毒sv40tag基因片段至sd大鼠牙囊细胞，获取具有无限增殖能力和稳定生物学性状的牙囊细胞用于牙周组织工程的研究。方法 利用293细胞包装病毒构建含sv40tag的逆转录病毒载体，制备重组逆转录病毒并转染至sd大鼠牙囊细胞。以正常牙囊细胞为对照，倒置显微镜下观察细胞形态及活力，分析细胞端粒酶活性，并检测其成骨分化及增殖特性。结果 转染sv40tag基因后，sd大鼠牙囊细胞传代至60代，生长依然旺盛，存在较强活力；牙囊细胞端粒酶活性显著增强，与对照组有统计学差异（p=0.033）；牙囊细胞成骨分化相关基因（碱性磷酸酶、骨钙素、骨形态发生蛋白、runx2基因）、促有丝分裂相关基因（碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子）的电泳条带与对照组均无统计学差异（p>0.05）。结论 sv40tag基因片段转染sd大鼠牙囊细胞后具有无限传代增殖和抗衰老的潜在能力，其细胞生物学特性相对稳定，可为牙周组织工程提供较理想的种子细胞来源。

[关键词] 牙囊细胞； 基因转染； 端粒酶； 成骨分化； 增殖

[中图分类号] q 813 [文献标志码] a [doi]

10.7518/hxkq.2013.01.002 牙囊细胞（dental follicle cells，dfc）来源于形成牙周组织始基的牙囊[1]，系牙周组织工程研究中受到广泛关注的种子细胞之一[2]。数量丰富并且细胞表型

和生物学性质稳定的种子细胞是牙周组织工程研究的前提[3]，

但是牙囊细胞体外培养的数量较少，容易

失去自我更新能力发生老化。通过转染外源性基因片段至目的细胞可以抑制细胞的衰亡，使有限的生命细胞转化成为具有长期传代能力和稳定表型的细胞。

猿肾病毒sv40大t抗原（simian virus 40 large tu-mor

antigen，sv40tag）是较常用和有效的外源性基

因之一[4]，目前国内外已成功将其用于牙骨质细胞

以及牙周膜成纤维细胞[5]的永生化构建。本研究将

sv40tag基因片段转染至体外培养的sd大鼠牙囊细胞，对其传代增殖能力和抗衰老能力、成骨分化及细胞增殖等生物学特征进行观察和检测，为牙周组织工程研究的种子细胞来源提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1周龄sd大鼠由重庆医科大学实验动物中心提供，含sv40tag片段质粒pssr69、pampho、293细胞均由重庆医科大学基础医学院罗进勇教授惠赠，胎牛血清、dmem培养基（hyclone公司，美国），胰酶、ⅰ型胶原酶、脂质体2000、二甲基亚砜（dimethyl sul-foxide，dmso）、聚凝胺（polybrene）、潮霉素（hygro-mycin）（sigma公司，美国），端粒酶逆转录酶（telome-rase reverse transcriptase，trt）抗体、山羊抗兔二抗、甘油醛三磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh）（cell

signaling technology公司，美国），焦碳酸二乙酯

（diethypyrocarbonate，depc）（bio basic公司，美国），rever tre

ace-a-逆转录试剂盒、sybrgreen逆转录试剂盒（toyobo公司，日本），琼脂糖（takara公司，日本）。

1.2 牙囊细胞体外培养及sv40tag基因转染

将sd大鼠引颈法处死后取出下颌第一磨牙牙胚，分离出牙囊组织立即置入dmem培养基并剪成l～2 mm大小的组织块。加入0.1%ⅰ型胶原酶37 ℃水浴消化1 h，0.25%胰蛋白酶消化5 min，离心弃上清液。加入dmem培养基3 ml转入培养瓶。5%co2、37 ℃、饱和湿度条件下培养，2～3 d换液1次，细胞生长形成单层后常规消化传代并鉴定细胞来源。37 ℃、5%co2饱和湿度培养箱中培养，细胞融合至75%～80%时胰蛋白酶消化传代。

利用293细胞包装病毒构建含sv40tag的逆转录病毒载体，制备重组逆转录病毒并转染至sd大鼠牙囊细胞。方法：将293细胞按30%～40%密度铺于t-25细胞培养瓶，待细胞贴壁（8～12 h）后，设置转染体系，将含有sv40tag片段的pssr69质粒1～2 μg、pampho质粒0.5～1.0 μg、脂质体2000 15 μl、dmem（无血

清、无双抗）250 μl混合均匀，室温放置15～20 min。将t-25细胞培养瓶中293细胞用3 ml无血清、无双抗的dmem洗涤2遍，再加入无血清、无双抗的dmem 2.5 ml。将设置好的转染体系加入细胞培养瓶，轻柔混合均匀。3～5 h后，将培养瓶中的培养基换成完全dmem 4 ml，在继续培养36、60、84、108 h后，分别收集细胞上清液（含有转染体系），合计收集约16 ml，低速离心5 min去

除细胞悬液，0.22～0.45 μm醋酸纤维膜滤器过滤，4 ℃保存备用。将牙囊细胞按20%～30%密度铺于t-25细胞培养瓶，等待细胞贴壁。在含有转染体系的293细胞培养上清液中加入80～100 μl聚凝胺，吸取sd大鼠牙囊细胞培养基，换成含有转染体系的细胞培养上清液4 ml，6～8 h后吸出上清液，再加入含有转染体系的细胞培养上清液

4 ml，过夜培养，第2天换成完全dmem 4 ml，培养4 h。2 μg·ml-1潮霉素筛选。

1.3 细胞形态学观察

以转染sv40tag后的dfc为实验组，正常dfc为对照组，连续传代至60代。在倒置相差显微镜下观察2组的细胞形态及生长状态。

1.4 转染sv40tag基因前后dfc端粒酶表达的检测

采用蛋白质印迹技术（western blot）检测转染

sv40tag基因前后dfc端粒酶的表达。以转染sv40-tag后的dfc为实验组，正常dfc为对照组。用预冷的pbs液清洗细胞，提取蛋白质于-20 ℃保存。配置工作液，酶标仪测定562 nm处的吸光度，绘制标准曲线蛋白定量。上样50 μg进行电泳，转膜，去除气泡，同时保持胶的湿润。将其放入电泳槽，胶面向阴极，然后放入充满缓冲液的缓冲槽，4 ℃电泳过夜后取出，弃胶。将膜放入染液中快速染色，然后放置于封闭液中，37 ℃下摇晃4 h。5%的脱脂奶粉脱色摇床上洗膜15 min，封trt一抗（1∶400）4 h，封二抗（1∶2 000）

2 h，洗膜，显影。应用image tool v

3.0图像分析软件进行图像分析，计算转染sv40tag基因前后dfc的灰度值以及相应的内参gapdh灰度值。

1.5 转染sv40tag基因前后dfc成骨分化相关基因

表达的检测

采用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription pcr，rt-pcr）检测转染sv40tag基因前后dfc成骨分化相关基因的表达。以转染sv40tag后的dfc为实验组，正常dfc为对照组，细胞消化后接种于96孔板，培养于加有矿化诱导液（地塞米松1×10-8

mol·l-1，β-甘油磷酸钠50 mg·l-1，维生素c 10 mmol·l-1）的培养基中诱导其骨向分化，于第6天提取细胞总rna，逆转录获取cdna，按逆转录试剂盒说明书，在冰盒中配置20 μl合成体系，加入1 μl cdna为模板进行扩增。rt-pcr法检测2组细胞内碱性磷酸酶（alka-

line phosphatase，alp）、骨钙素（osteocalcin，oc）、

骨形态发生蛋白（bone morphogenesis protein，bmp）2、runx2基因的表达。各引物序列见表1。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外灯下观察电泳条带并拍照记录。

1.6 转染sv40tag基因前后dfc促有丝分裂相关基

因表达的检测

rt-pcr法检测转染sv40tag基因前后dfc促有丝分裂相关基因的表达。以转染sv40tag后的dfc为实验组，正常dfc为对照组，

检测碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bfgf）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，igf）的表达。引物序列见表2。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外灯下观察电泳条带并拍照记录。

2 结果

2.1 细胞生长情况观察

原代培养12 h后，倒置显微镜下见已贴壁的细胞呈梭形或多角形，胞体丰满，胞突细长，细胞质丰富均匀，核圆居中。原代培养6～7 d后，可按1∶2进行传代。传代9～10代后，细胞胞体变圆，结构模糊，细胞质内出现颗粒，细胞增殖明显减慢，提示细胞呈衰老征象。

转染sv40tag基因后，dfc细胞以多角形居多，呈束状、栅栏状或旋涡状排列（图1）。细胞传代至60

代，生长依然旺盛，存在较强活力。对照组dfc传代至9～10代后细胞活性降低，出现凋亡，难以继续传代。

fig 1 morphology of dfc infected with sv40tag inverted mi-

croscope × 200

2.2 转染sv40tag基因前后dfc端粒酶的表达

western blot检测表明，实验组trt灰度值明显高于对照组（图2），二者之间有统计学差异（p=0.033），表明转染sv40tag基因后dfc端粒酶活性明显增强。

fig 2 the trt expression of dfc

2.3 转染sv40tag基因前后dfc成骨分化相关基因的

表达

经rt-pcr扩增后，可见gapdh扩增片段大小为500 bp，实验组和对照组的alp、oc、bmp2、runx2基因的电泳条带均无统计学差异（p>0.05，图3）。

fig 3 expression of alp， oc， bmp2 and runx2 by rt-pcr

2.4 转染sv40tag基因前后dfc促有丝分裂相关基因

的表达

经rt-pcr扩增后，可见gapdh扩增片段大小为

500 bp，实验组和对照组的bfgf、igf基因的电泳条带均无统计学差异（p>0.05，图4）。