各类质粒载体图谱、序列及酶切位点大全(非常有用)

载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。

一、一个合格质粒的组成要素a复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。

原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。

而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。

b 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+c 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段d P/E 启动子/增强子e Terms 终止信号f 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。

（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。

（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。

（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。

第三步：看多克隆位点（MCS）。

它具有多个限制酶的单一切点。

便于外源基因的插入。

如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。

决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源DNA插入片段大小。

质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。

一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。

第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。

这是用来区别克隆载体与表达载体。

克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。

选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。

启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号a 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。

b增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。

LentiCRISPRV2载体使用说明
一载体简要说明
1 克隆gDNA使用BsmBI酶切位点，载体可以切出1.9kb的filter，便于确定载体酶切成功，并且利于胶回收。

2 BsmBI酶切位点如图酶切后不需要用CIP脱磷，也不会自连。

3在cas9的C端有FLAG，可以WB或Immunostaining来检测。

4 EFS被优化的小而强，方便慢病毒的包装，极大的提高了慢病毒包装的效率。

5 优化的内部核糖体插入位点P2A，可以在只有EFS启动的情况下独立表达puromycin来筛选转染或感染成功的细胞。

二 gDNA设计说明
对于lentiCRISPR V2克隆，其合成的oligo末端与px330不同如下图所示：
具体举例如下：一定注意oligo的方向，载体的hU6的下游正义链一定是基因组序列的有义链，否则编辑无效,且5’端必须第一个碱基必须是G如果不是G也要认为加一个G满足U6启动子的需求。

将引物稀释 100uM 后，再 10 倍稀释
退火
50ul 体系
引物 20ul（上下游各 10ul）、
水 25ul、
NEB buffer 2（10*）5ul 95℃，5min。

然后关闭 PCR 仪，自然降温 40min。

LentiCRISPR V2 载体酶切
200ul体系：
BsmBI 2ul；
10*buffer 20ul；
质粒 10ul（2ug）
水 16ul 55℃，酶切 2 小时胶回收
连接
2*solutionI 5ul
退火引物 4.5ul
线性化载体 0.5ul 16℃连接过夜，转化挑菌送测序。

(ocDNA)，即OC构型； L构型: 质粒DNA经酶切，发生双链断裂而形成线 性分子(LDNA)，L构型。（见图）
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环形双链DNA质粒分子的三种构型
OC L
SC
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不同质粒DNA分子量差异显著，最小的仅能编码2－3 种蛋白质，分子量约为106 ，最大的可达108。
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1、pSCl01质粒载体
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pSCl01质粒作载体克精选隆可编非辑洲ppt爪赡的基因
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2、CoLEl质粒载体
2
一、质粒的定义、命名、分类、分布
定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立于染色体外 的自我复制并稳定遗传的环状双链DNA分子。
命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发 明者，后接实验编号，
分类： 分布：
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3
质粒分类
1、根据质粒的性状特征分为：
1）F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。 2）R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数种抗菌
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质粒DNA拷贝数的控制
高拷贝质粒DNA复制的启动，是由质粒编码基因合成的 功能蛋白质调节的，与寄主细胞周期开始时合成的不稳 定的复制起始蛋白质无关。
低拷贝质粒的复制是受寄主细胞不稳定的蛋白质控制的， 并与寄主细胞染色体同步进行。
用蛋白质合成抑止剂氯霉素或壮观霉素处理寄主细胞， 使染色体DNA复制受阻的情况下，松弛的质粒仍可继续 扩增。而严紧型质粒则不行。
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3、失控的质粒载体
有一些低拷贝数的质粒，其复制控制时温度敏感型的， 即在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化，这类质粒 称失控的质粒载体。

【原创】找质粒.载体图谱及序列的方法
在相关版面看到n个这样的帖子：“请问....质粒的图谱?" "请问质粒...的酶切位点?"....
诸如此类的问题，多之甚多。

因此，友情提醒按以下方法查找质粒相关信息:
1.Vectorpedia：输入质粒骨架，直接查询，非常方便;
2. google
检索式子：质粒名＋ map
质粒名＋sequence ＋filetype:txt or filetype:pdf
或者：进入google，点击"图片搜索"，直接查找图谱.
3.google scholar: /
有些质粒是经过改造的，所以通过上述方法不能查询到相应信息。

这时，可以在google scholar中输入质粒名称，可以直观地看哪些学者在何文章中使用了该质粒，从而可了解到质粒的来源;或者籍此向作者咨询或索取。

4.尝试从各大生物公司，例如invitrogen网站查询.
5. 这个网站收录了大量图谱：
PET系列载体信息：
本人一点想法，供参考。

希望版面内不要出现类似的帖子，浪费
斑竹和其他战友的时间，也影响自己的工作。

:P。