反胶团萃取研究进展
摘要：反胶团萃取是近年发展起来的分离和纯化生化物质的新方法,本文介绍了反胶团萃取蛋白质技术的原理和机制、影响反胶团中蛋白质稳定性的因素、在提取分离蛋白质领域的应用以及反胶团萃取技术的研究展望。
关键词：反胶团萃取；研究进展；分离技术
传统的液-液萃取分离技术具有操作连续,多级分离,放大容易和便于控制等优点,已广泛用于多组分物质的分离。但是生物产品的分离与一般的化工产品不同,它既要求有较高的提取率,又要求较高的活性保持率。由于大部分蛋白质，氨基酸等一些生物活性物质不溶于非极性有机溶剂，而且有机溶剂有可能会导致这些物质失活，所以传统的液-液萃取分离技术难应用于蛋白质等生物物质的提取和分离。近年来,可以选择性的分离特定生物活性分子的反胶团溶液萃取分离技术,逐渐引起了人们的重视。
1977年,瑞士的Luisi[1]等人首先发现胰凝乳蛋白酶可以溶解于含有表面活性剂的有机溶剂中,并首次提出了用反胶团萃取蛋白质的概念。这种萃取技术具有成本低,选择性好，分离效率高、速度快、条件温和，能使生物物质保持较高的活性收率，易放大，正萃和反萃同时进行等优良特性。经过二十多年的研究发展，目前已广泛应用于蛋白质的分离和纯化,并逐渐延伸至其他生物工程产品,如氨基酸、抗生素、核酸等的分离，研究结果显示出反胶团萃取技术具有良好的应用前景。
1反胶团萃取技术的概述
1.1 反胶团形成与萃取原理
反胶团(ReversedMicelles)是是指向非极性溶剂中加入表面活性剂时，当表面活性剂的浓度超过临界胶团浓度时，会在非极性溶剂内自发形成亲水头部向内、疏水尾部向外的具有极性内核的表面活性剂聚集体，具有热力学稳定的有序结构。通常反胶团的极性内核在溶解了水后在内核中形成“微水相”或“水池”，可以进一步溶解蛋白质、核酸、氨基酸等亲水性的生物大分子。胶团的屏蔽作用使这些物质不与有机溶剂直接接触，而“水池”的微环境又保护了生物物质的活性，从而达到了溶解和分离浓缩生物物质的目的[2]。
反胶团萃取一般采用离子型表面活性剂制备反胶团相，因此这些表面活性剂所形成的反胶团内表面带有负电荷或正电荷。当改变水相pH值可使蛋白质表面带正电荷(pHpI)，通过与表面活性剂发生强烈的静电相互作用，使蛋白质溶解在反胶团中。理论上，当溶质所带电荷与表面活性剂相反时，由于静电引力的作用，溶质易溶于反胶团，静电引力越大溶解率或分配系数较大，反之，则不能溶解到反胶团相中。反胶团结构的大小取决于“水池”中的含
水量W0。W0是“水池”中溶入的水与表面活性剂的摩尔比。在W0<10时，水分子被团缚在反胶团的壁上,它的凝固点下降、共价键参数改变、氢键破坏；只有在W0较大时,才存在自由水。含反胶团的有机溶剂与蛋白质水溶液接触时,反胶团依靠静电作用、范德华力、氢键作用等使蛋白质进入“水池”中。
2、影响反胶团萃取的因素
2.1水相pH值的影响
表面活性剂的极性头朝向反胶团的内部，使反胶团的内壁带有一定的电荷，而蛋白质是一种两性电解质，通过改变水相pH值可改变蛋白质的表面电荷。当蛋白质所带电荷与反胶团内所带电荷的性质相反时，由于静电引力，可使蛋白质转移到反胶团中。通过改变水相pH，由于静电斥力，可使蛋白质从反胶团相反萃取到水相中。例如：当用阴离子表面活性剂AOT构成反胶团时，其内壁带负电荷，若水相的pH值低于蛋白质的等电点pI，则蛋白质带正电荷，在静电引力的作用下，使蛋白质进人反胶团而实现了萃取。相反，当pH高于pI时，由于静电斥力，使溶入反胶团的蛋白质反向萃取出来，实现了蛋白质的反萃。若使用的是阳离子表面活性剂，则情况与上相反。因此，水相的pH值是影响反胶团萃取蛋白质的最重要因素。
刘海远等[3]在利用AOT反胶团萃取大豆蛋白的过程中分析得出，萃取体系pH在5.5~6.5时，蛋白质的萃取率增加；pH在6.5~8.5时，蛋白质的萃取率下降，在pH为6.5时，蛋白质萃取率为最大。庹浔等[4]在CTAB-己醇-辛烷体系分离纯化醇脱氢酶的反萃取研究中分析得出，CTAB 是阳离子表面活性剂,水相溶液的pH值需高于蛋白质的pI值(ADH的pI=5.4),反胶团萃取才能进行,但若pH值过高则会使ADH变性,实验得出初始水相pH为7.8时,ADH的萃取率最大。
2．2水相离子强度的影响
研究发现改变反离子种类对反胶团体系的蛋白萃取率影响显著。反离子种类对萃取率的影响是由于它使反胶团的大小发生了变化。离子的水合半径越大,它从带电的胶团内表面附近被体积排斥出去的效应就越显著,进而削弱了横向表面活性剂极性头之间排斥力的屏蔽,导致形成较大的反胶团。改变离子种类及改变离子强度会使蛋白质分子的溶解性下降，甚至使已溶解的蛋白质从反胶团中反萃取出来。
柳畅先等[5]利用反胶团萃取醇脱氢酶，研究表明当离子强度增大时,反胶团内表面的双电层变薄,减弱了蛋白质与反胶团表面之间的静电吸引,从而减少了蛋白质的溶解度,也减弱了表面活性剂极性基团之间的斥力,使反胶团变小,蛋白质不能进入其中，当盐浓度为零时,萃取率在90%以上,随着盐浓度逐渐增加,萃取率不断下降,直至为零。
2.3表面活性剂、助表面活性剂的影响
常用的形成反胶团的表面活性剂有: 二(2-乙基已基)丁二酸磺酸钠(AOT)、Tween类非离子表面活性剂、山梨糖醇酯类(Span)、各种聚氧乙烯类表面活性剂、烷基三甲基卤化铵和磷脂类等。表面活性剂的种类决定其能否形成反胶团，以及反胶团粒径大小，因而决定能否有效地溶解蛋白质。表面活性剂种类、化学组成以及浓度都会影响到萃取效率和生物物质的活性。蔡海燕[6]等人研究表明，生姜蛋白酶的pI=5.4~5.5,在pH 5.4以上,用AOT-异辛烷反胶团不能萃取出生姜蛋白酶,但是却可以萃取出71.86%的杂蛋白。用CTAB庚烷/辛醇反胶团二次萃取AOT-异辛烷萃余液,其蛋白质萃取率为60.25%,萃取液中生姜蛋白酶理论比活力达到49.77(μg Pro/μgPro·min-1)。由于常用的几种表面活性都有其各自的局限性，已不能满足发展的需要，所以研究开发廉价、高效、无毒的生物表面活性剂是未来的发展趋势。
蛋白质的分子量往往很大，超过几万或几十万，使表面活性剂形成的反胶团的大小不足以包容大的蛋白质，而无法实现萃取，此时加入一些助表面活性剂，使它们插入反胶团结构中，能提高生物催化反应的活性和稳定性。Koichiro等[7]采用AOT-TOA混合反胶团萃取溶菌素酶和牛血清蛋白（BSA）的研究。AOT/TOA体系与酸性原料液混合时，TOA与H+结合形成阳离子铵盐，铵盐能和极性头带负电的AOT作用形成复合物，从而改变反胶团的性能。
2.4温度影响
温度对反胶团的生物催化反应的影响同对其他溶液一样。当温度升高到一定时, 反应活性达到最大。Kazumitsu Naoe [8]等人的研究表明: 在DK-F-110体系中, 40℃时脂肪酶的反应活性最大,随温度升高, 脂肪酶活性降低。大部分生物物质的活性对温度变化较为敏感，在一定范围内升高温度会提高产品活性收率，但当温度继续升高，生物物质活性收率将会降低。
3 反胶团萃取技术的应用范围
3.1反胶团萃取技术在提取分离蛋白质领域的应用
3.1.1分离蛋白质混合物
分子质量相近的蛋白质, 等电点或其他因素的不同会引起溶解度的差别, 从而可利用反胶团溶液的选择性予以分离。段海霞等[9]人选择琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸钠AOT-异辛烷反胶团萃取体系,研究了β-乳球蛋白单一蛋白体系中以及β-乳球蛋白与免疫球蛋白(1:1)混合物体系中蛋白质的分布特性,探讨AOT-异辛烷反胶团体系分离分级乳蛋白的机理。实验条件下,β-乳球蛋白在单一蛋白或混合蛋白体系中的反胶团萃取率均随着水相pH值增加而降低, 随水相[Na+]升高而逐渐增加，随水相起始蛋白质量浓度增加而降低，若体系中共存的IgG可明显促进β-乳球蛋白在反胶团中的增溶,在混合蛋白质体系中,β-乳球蛋白与IgG可分别趋于富集在有机相和水相,显示出AOT-异辛烷反胶团体系在牛初乳乳清蛋白分级分离方面具有应用潜力。
3.1.2纯化蛋白质
