几种中药提取物对不同病原菌的抑制作用

几种中药提取物对不同病原菌的抑制作用作者：张文芳高郁芳来源：《农民致富之友》2017年第07期随着时代的发展，人们健康意识的逐渐提高，环境与农产品的安全性受到了广泛重视，而且对农药残留的限制也要求的很严格。

近年来，化学农药被大量使用于农业生产中，由于多数在自然环境中不易降解，蓄积能力强，导致污染了环境，使病虫害产生了抗药性，破坏了生态平衡，农作物及畜产品中农药残留量超标，危害了人体健康。

而最值得注意的是生产这些化学农药过程中三废的排放问题，按我国1998年生产化学农药约18万t计，年排放的三废超过40万t[1]。

因此，化学农药的使用量势必会不断下降，而植物源农药将替代化学农药广泛应用于农业生产中。

植物源农药的活性成分是自然存在的物质，在自然界中的降解不污染环境，不会对人体产生危害，且低毒、低残留、病虫害不易产生抗药性，农产品的高品质能够得到充分保留。

植物源农药活性成分复杂，通常能作用于靶标生物的多个位点，有利于延缓靶标生物的抗药性；有些植物源农药还能刺激植物生长，起到生长调节作用[2]。

因此植物源农药在农业生产中具有广阔的应用前景。

纪淑娟等对丁香抑菌成分超声波提取工艺进行研究，得到以95%乙醇为溶剂的提取物对灰葡萄孢菌的抑菌率为62.47%[3]；杨帮等对美洲商陆抑菌活性进行研究，得出以极性强的甲醇为溶剂对柑橘绿霉病和小麦纹枯病2种病原菌的抑菌率均达100%[4]；崔永明等在甘草总黄酮的提取技术及其抑菌活性研究中指出甘草总黄酮对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用均较为明显[5]；杨国平等通过天南星提取物对小鼠S180肉瘤的抑制作用的研究，得出天南星醇提物对小鼠S180肉瘤表现出明显的抑制生长作用，并未造成明显毒害作用[6]。

根据上述文献可知，丁香、商陆、甘草、天南星对不同致病菌有很强的抑制生长作用，而为研究不同中药提取物对不同致病菌的抑制作用，本试验选用8种中药材的提取物对4种主要致病菌进行抑菌活性研究，以筛选出对主要致病菌有抑制作用的中药提取物，对于开发和利用我国丰富的中药植物资源，有着十分重要的意义。

1 试验材料1.1 试验仪器与试剂LRH—280型微电脑控制生化培养箱、LDEX—40SCⅠ型立式自动电热压力蒸汽灭菌器、无菌操作台、高压蒸汽灭菌锅、回流提取器、HH—S型恒温水浴锅、培养皿、试管、分析天平﹑托盘天平﹑玻璃棒﹑烧杯、量筒、锥形瓶、玻璃吸管﹑酒精灯﹑涂布棒、打孔器、接菌环、挑针、记号笔等。

95%乙醇、75%乙醇、无菌水等。

1.2 供试菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli），由吉林农业科技学院微生物实验室提供；带有薏苡弯孢叶斑病菌的病叶和菜豆灰霉病菌的病果，均采自吉林农业科技学院九站校区药植园。

1.3 供试药材辛夷（Magnolia biondii Pamp.）的干燥花蕾、艾蒿（Artemisia argyi Levl.et Van.）的干燥叶、北豆根（Menispermum dahuricmn DC.）的干燥根茎、天南星[Arisaema erubescens （Wall.） Schott]的干燥块茎、丁香（Eugenia aromatica Baill）的干燥花蕾、商陆（Phytolacca acinosa Roxb.）的干燥根、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根和根茎、萝藦[Metaplexis japonica （Thunb.） Mark.]的干燥全草，以上药材均购自国营中药材药店。

1.4 培养基PDA培养基：土豆 200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，水 1000ml；高温湿热灭菌：121℃30min。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl 5g，琼脂 20g，水 1000ml；pH 7.0-7.2；高温湿热灭菌：121℃ 30min。

2 试验方法2.1 病原菌的分离、纯化与鉴定2.1.1 薏苡弯孢叶斑病菌的分离、纯化与鉴定取带有病斑的薏苡叶，于病健交界处剪成2mm×5mm的长方形小块，在无菌操作台中对其进行表面消毒，先置于75%乙醇中灭菌25s，取出，然后放入到0.1%升汞中灭菌3-5min，取出，再放入到无菌水中洗涤3次。

将上述经灭菌的病组织采用五点法接种于PDA培养基上培养，倒置于28℃的恒温箱中培养3-5d，观察菌体生长情况，挑取组织边缘长出的菌丝，接种到新培养基中，多次重复挑取、接种，进行纯化。

根据左淑珍等对玉米弯孢菌叶斑病及其抗源鉴定、抗性遗传研究现状鉴定此种病菌为薏苡弯孢叶斑病菌（Coix curvularia lunata）[7]。

2.1.2 菜豆灰霉病菌的分离、纯化与鉴定菜豆灰霉病菌的分离采用菌丝直接挑取培养法。

将带病的病果用无菌水擦洗干净，在无菌操作台上，用75%乙醇擦拭没有菌丝的部分进行表面消毒，用消毒过的镊子拨开表层菌丝，挑取内层的菌丝，将其接种于PDA平板培养基上，倒置于28℃恒温箱中培养，3天后观察、挑取边缘菌丝，将其移至新培养基上培养，进行纯化。

根据杨素梅等对菜豆灰霉病的发生与防治措施的研究鉴定该病菌的病原菌为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）[8]。

2.2 中药提取液的制备将上述中药材料粉碎，取粉碎的各类药粉30g，以95%乙醇为溶剂（药粉：95%乙醇=1：15[3]），采用回流提取法提取4h（提取温度为85℃），然后将提取液置于旋转蒸发仪中进行浓缩，再用95%乙醇定容，使溶液的浓度为1g/ml，然后移置广口瓶中，密封，保存于4℃冰箱中，备用。

2.3 供试菌种的活化扩繁与菌悬液的制备薏苡弯孢叶斑病菌、菜豆灰霉病菌的活化扩繁：将冰箱中纯化的病原菌取出，在无菌操作台中分别用灭菌后的接种环接种于新PDA培养基上，在28℃恒温箱中培养3-5d，备用。

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的活化：分别将菌种用接种环接种于含牛肉膏蛋白胨培养基试管中，37℃恒温培养24h，备用。

菌悬液的制备：将20ml无菌水倒入含已活化好的细菌的试管中，用灭菌的接种环将菌种挑起，稍加振摇，既得金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的菌悬液。

2.4 几种中药提取物的抑菌活性测定2.4.1 几种中药提取物对病原真菌的抑制作用采用生长速率法[9]，测定各类药材1g/ml的乙醇提取物对供试菌种的抑制效果。

在无菌条件下，取各类药材提取物1ml分别加入无菌的直径9cm培养皿中，对照组加入等量95%乙醇，再加入10mlPDA培养基，混匀，待其凝固后，得到含药平板。

用直径0.6cm 的打孔器分别制得薏苡弯孢叶斑病菌和菜豆灰霉病菌的菌饼，用挑针将菌饼接种于含药平板中央，28℃条件下进行恒温培养，每次处理重复3次。

3d后开始观察菌落大小，并采用十字交叉法测量菌落直径，连续测量4d，并记录数据，计算抑菌率[9]。

菌落生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-打孔器直径）×100%所得结果通过spss软件进行方差分析，进而采用SNK-q检验法进行显著性检验。

2.4.2 几种中药提取物对细菌的抑制作用采用滤纸片法[10]，测定各类药材1g/ml的乙醇提取物对供试菌种的抑制效果。

用打孔器将滤纸打成直径0.8cm的圆片，经高压蒸汽灭菌后，放入盛有各提取物的容器中浸泡1h，对照组滤纸片用95%乙醇浸泡。

向平板中的培养基表面加入0.5ml已配制的金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的菌悬液，用三角涂布棒将其均匀涂布，采用五点法将浸泡好的滤纸片放入到平板中，每次处理重复3次，于37℃条件下恒温培养24h，然后用十字交叉法测量抑菌圈直径。

用表示抑菌圈的直径。

2.5 几种中药提取物的最小抑菌浓度测定通过上述实验，筛选出丁香和辛夷对两种病原真菌、商陆对菜豆灰霉病菌分别作最小抑菌浓度试验。

在无菌条件下，用95%乙醇将各提取物稀释成稀释度为1/2、1/4、1/8、1/16、1/32的溶液，分别精取各浓度溶液1ml与适量PDA培养基混合均匀，制成含药培养基，冷却，备用。

将打好的病原菌菌饼接种到含药培养基上，倒置于28℃恒温箱中培养，每次处理重复3次，从第3d开始观察，每间隔1d观察一次，连续观察至第7d。

得到最小抑菌浓度[9]。

3 结果与分析3.1 几种中药提取物对真菌的抑制作用3.1.1 几种中药提取物对菜豆灰霉病菌的抑制作用由表3-1可知各类中药提取物除天南星外都对病原菌的生长产生了抑制作用，其中辛夷、商陆和丁香的提取物对菜豆灰霉病菌的抑菌率均达100%，与其他中药提取物有极显著性差异；其次是北豆根和萝藦的提取物，抑菌率达到76.3%；甘草提取物的抑菌率为69.7%；艾蒿提取物的抑菌率相对较低，为33.8%；天南星提取物对菜豆灰霉病菌无抑制作用。

从结果来看，辛夷、商陆和丁香的提取物表现出较强的抑菌活性，可见，辛夷、商陆和丁香提取物中含有的抑菌活性成分较多。

3.1.2 几种中药提取物对薏苡弯孢叶斑病菌的抑制作用由表3-2可知各类中药提取物都对病原菌的生长产生了抑制作用，其中辛夷和丁香的提取物对薏苡弯孢叶斑病菌的抑制效果最好，抑菌率达到100%；其次是甘草和商陆的提取物，抑菌率也达到83%左右；而北豆根、萝藦和艾蒿提取物的抑菌率也分别达到了70.8%、65.4%、59.1%；天南星提取物对薏苡弯孢叶斑病菌的抑制作用不是很明显，抑菌率为2.5%。

从结果看，辛夷和丁香的提取物中抑菌成分的活性较强，可见，辛夷和丁香中的抑菌活性成分为醇溶性成分。

3.2 几种中药提取物对细菌的抑制作用由表3-3可知，几种中药提取物对大肠杆菌的抑制效果整体比对金黄色葡萄球菌的抑制效果好，其中丁香提取物的活性最强，甘草、商陆和萝藦的提取物的活性较弱；而这些提取物对金黄色葡萄球菌也有不同程度的抑制效果，甘草和丁香提取物的活性最强，而辛夷和艾蒿提取物对金黄色葡萄球菌均表现为无活性。

从结果看，丁香提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有很强的抑制作用；而甘草提取物只对金黄色葡萄球菌表现出很强的活性。

3.3 几种中药提取物的最小抑菌浓度由表3-4可以看出，不同稀释度的辛夷提取物对真菌的抑制效果不同，浓度越大，抑制效果越好。

实验得出，辛夷提取物对菜豆灰霉病菌和薏苡弯孢叶斑病菌的最小抑菌浓度分别为0.125g/ml、1g/ml。

由表3-5可以看出，不同稀释度的丁香提取物对菜豆灰霉病菌和薏苡弯孢叶斑病菌的抑制效果基本相同，最小抑菌浓度均为0.0625g/ml。

由表3-6可以看出，不同稀释度的商陆提取物对菜豆灰霉病菌的抑制效果也是随着浓度的降低而减弱。

实验得出，商陆提取物对菜豆灰霉病菌的最小抑菌浓度为0.5g/ml。

综上所述，8种中药提取物除天南星提取物外对两种病原菌均有很好的抑制效果。