大肠杆菌离子束诱变及rpoB基因两个新的利福平抗性位点鉴定

大肠杆菌的遗传分析与研究大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道居住菌，广泛存在于人类和其他暖血动物的消化系统中。

作为一种常见的模式生物，大肠杆菌的研究对于人类健康和生物技术的发展都具有重要意义。

遗传分析在大肠杆菌的研究中起着关键作用。

大肠杆菌具有简单的遗传结构和遗传变异机制，使其成为研究基因组遗传、表达和调控的理想模型。

大肠杆菌的基因组大小约为5.4Mb，含有大约5400个基因，其中包括编码蛋白质的基因和非编码RNA基因等。

大肠杆菌的遗传分析主要涉及到突变和遗传重组两个方面。

突变是指基因组中的一部分发生了突然的变化，可以导致遗传信息的改变。

大肠杆菌研究中常用的突变类型包括点突变、缺失、插入和倒位等。

点突变可以通过突变诱变剂或者自发发生的自然突变来引入，从而通过分析突变后的表型和基因组信息来研究基因的功能。

缺失、插入和倒位等突变可以通过基因工程技术引入到大肠杆菌中，用来研究基因的调控和互作关系。

遗传重组是指DNA的重排和交换，由于大肠杆菌具有双链DNA的特点，使得遗传重组在大肠杆菌的研究中得以广泛应用。

通过遗传重组，可以将来自不同源的DNA片段进行重组，产生新的遗传信息，用来研究基因间的相互作用和调控网络。

遗传重组可以通过化学诱变剂、电转化和质粒传递等方法进行，进一步帮助研究人员揭示基因之间的相互作用和调控机制。

除了突变和遗传重组外，大肠杆菌的遗传分析还包括遗传图谱的构建和基因组测序等技术。

遗传图谱通过观察相对于遗传距离的联锁关系来帮助确定基因在染色体上的位置，从而帮助研究人员进一步理解基因的相互作用关系和调控机制。

基因组测序是指对大肠杆菌基因组中的所有DNA序列进行测定和分析，以了解全基因组的结构和功能。

基因组测序技术的发展使得我们对大肠杆菌的遗传信息有了更为全面的认识，也提供了更多的研究思路和方法。

大肠杆菌的遗传分析与研究对于人类健康和生物技术的发展具有重要意义。

通过对大肠杆菌的遗传分析和研究，我们可以更好地理解基因的功能和调控机制，有助于人类疾病的研究和治疗，也为基因工程和生物合成等领域的技术发展提供了重要的参考。

大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选生命科学学院09级生物技术1班余振洋200900140156指导老师：林建群同组者：潘红芳摘要营养缺陷型菌株是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段，在发酵工业上有广泛用途。

本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，计划通过诱变得到并筛选出营养缺陷型，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤并掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。

关键词营养缺陷，诱变，生长谱测定，大肠杆菌（E.coli）1．引言1.1 营养缺陷型营养缺陷型是指缺乏合成某种对自身生长繁殖所必须的营养物质（氨基酸、维生素、碱基等）的能力的突变型，只能从周围环境或培养基中获得这些物质或其前体物才能正常生长。

由于营养缺陷型不能合成某种末端产物，解除了合成代谢的反馈抑制作用，限量添加所需生长因子克服生长障碍后，可选择性大量合成积累所需的中间代谢产物。

因此，营养缺陷型在工业上有重要的应用价值。

营养缺陷型是由野生型突变产生，营养缺陷型经回复突变恢复野生表型得原养型。

1.2 紫外线诱变紫外线是一种短波光，波长介于100-400nm之间。

紫外线是一种非电离辐射诱变剂，照射物体时可使原子的内层电子能级提高，但不能使原子失去电子。

紫外线是微生物育种中最常用的诱变剂之一。

由于碱基间电子的相互作用，DNA分子在260nm处有最大的紫外吸收峰，因此决定了紫外线诱导细胞发生突变的有效波长为260nm。

15W紫外灯产生的紫外线中，80%集中在260nm左右，诱变效应良好。

低剂量紫外线可诱变获得较多的正突变，高剂量紫外线则易产生大量负突变，但可获得特性明显改变的突变菌株。

紫外线诱发突变的原理是使DNA同一链上的两相邻胸腺嘧啶之间发生交联，形成胸腺嘧啶二聚体。

在DNA复制时，相应核苷酸无法与胸腺嘧啶二聚体配对形成碱基对，DNA复制中断，引起突变。

当细胞中的DNA分子含有大量胸腺嘧啶二聚体时，SOS修复机制被激活，DNA被修复，但包含大量错配的碱基对，从而导致基因突变。

整理by raimiDICP-1816 菌株管理档案1——细菌菌株基因型及基因符号说明 1大肠杆菌基因型及遗传符号说明前言：实验室的一般大肠杆菌拥有4288 条基因，每条基因的长度约为950bp，基因间的平均间隔为118bp（基因Ⅷ）。

E.coli 基因组中还包含有许多插入序列，如λ-噬菌体片段和一些其他特殊组份的片段，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的，由此表明了基因组具有它的可塑造性。

利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基因发生突变或缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种能观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype)，把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基因型（Genotype）。

具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。

分子克隆中常用的大肠杆菌及其遗传标记按Demerec 等1966 年提出的命名原则，采用的菌株所有的基因都假定处于野生型状态，除非在基因型上另外注明。

大肠杆菌基因型的表示方法（Demerec, et, al. 1966）：一、一般规则：1、根据基因产物或其作用产物的英文名称的第一个字母缩写成3 个小写斜体字母来表示。

例如：DNA Adenine Methylase→dam。

2、不同的基因座，其中任何一个突变所产生的表型变化可能相同，其表示方法是在3 个小写斜体字母后加上一个斜体大写字母来表示区别。

例如：Recombination→recA、recB、recC。

3、突变位点应通过在突变基因符号后加不同数字表示。

如supE44（sup 基因座E 的44 位突变）。

如果不知道几个等位基因中哪一/几个发生了功能性突变，则用连字符“-”代替大写字母，如trp-31。

4、细菌的基因型中应该包含关于其携带的质粒或附加体的的信息。

这些符号包括菌株携带的质粒或附加体、质粒或附加体上的突变基因座和突变位点。

其基因符号应与基因座的表示符号明显区别，符号的第一个字母大写、不斜体并位于括号内；质粒或附加体上的突变基因座和突变位点的基因符号的表示方法与染色体上突变基因座、突变位点的符号相同。

大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选0740063 阿噟兰1.前言抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。

但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。

在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。

当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。

如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。

DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。

紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。

因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。

一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。

选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。

在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。

本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。

若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。

紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。

因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。

在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。

2.材料和方法2.1实验材料、仪器和试剂菌种：大肠杆菌仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水2.2实验方法2.2.1制备培养基普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）：牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml Ph7.0按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。

大肠杆菌中抗生素耐药性的产生与演化机制研究抗生素是现代医学中不可或缺的治疗工具，但其过度使用与滥用导致了抗生素耐药性的迅速发展，成为全球公共卫生问题之一。

其中，大肠杆菌作为常见的病原菌，其抗生素耐药性已引起广泛关注。

大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，广泛存在于人和动物的肠道中，也可通过食品和水源传播。

在临床治疗中，大肠杆菌是导致呼吸道感染、尿路感染和血流感染等疾病的常见致病菌。

但随着抗生素的广泛使用，大肠杆菌的抗药性不断增强，严重威胁到了人类健康。

抗生素耐药性的产生与演化机制，是一个复杂的过程，需要从基因水平深入探索。

目前，大肠杆菌抗生素耐药性的主要机制包括基因变异和水平基因转移两种形式。

在基因变异方面，大肠杆菌的某些基因会发生突变，造成药物靶标的结构改变，或者阻止药物与靶标的结合，从而导致耐药性的产生。

例如，利福平（Levofloxacin）是一种广谱抗菌药物，能够干扰DNA合成从而杀死细菌。

但一些大肠杆菌产生了靶标蛋白水解酶的突变，使细菌对利福平产生耐药性。

在水平基因转移方面，大肠杆菌的耐药性可以通过吸收来自其他细菌的耐药基因而获得。

这是由于细菌之间的质粒互相传递，将耐药基因表达出来，从而实现细菌的耐药能力。

此外，在环境中，大肠杆菌还会通过水平基因转移获得新的耐药性。

例如，大肠杆菌可以在环境中暴露于许多抗生素，细菌会选择自身利益最大的方案，从而带来了更为复杂的耐药性机制。

基因水平的变化是大肠杆菌耐药性产生与演化的重要机制，也是抗生素耐药性问题的核心所在。

然而，不同的大肠杆菌株之间的基因特征也是有所差异的，他们所受环境不同，发生基因变异与水平基因转移的机率也不同，导致抗生素耐药性的种类和程度也不尽相同。

在对大肠杆菌抗生素耐药性的研究中，基因组学成为了重要的研究手段。

随着技术的不断提升，大肠杆菌基因组数据的获取和分析变得更为简便和高效。

通过比对，可以发现不同大肠杆菌株之间的差异，分析其基因水平的变化和耐药性的特征。

扬州市结核分枝杆菌利福平耐药基因突变分析发表时间：2019-05-28T10:05:48.223Z 来源：《医药前沿》2019年9期作者：戴洁1 曾方林1 王金富（通讯作者）1,2 [导读] 目的：了解本地区结核分枝杆菌利福平耐药基因的突变特征。

（1扬州市第三人民医院江苏扬州 225025）（2扬州大学人兽共患病学重点实验室江苏扬州 225002）【摘要】目的：了解本地区结核分枝杆菌利福平耐药基因的突变特征。

方法：利用基因芯片检测346例经鉴定为结核分枝杆菌的菌株利福平耐药基因，分析本地区利福平耐药基因突变特征。

结果：346例结核分枝杆菌中利福平耐药基因发生突变的例数为58例（16.7%）。

利福平rpoB基因耐药位点分布如下：531位点为58.6%，526位点为31.1%，511位点为6.9%，516位点为3.4%。

结论：本地区MTB对利福平耐药rpoB基因耐药位点以531位点最多，526位点次之。

【关键词】结核分枝杆菌；基因突变；利福平【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）09-0223-02 利福平（RFP)是从利福霉素B得到的一种半合成抗生素，能抑制细菌DNA转录合成RNA，达到杀菌作用。

绝大多数的RFP耐药相关基因是rpoB（RNA聚合酶 β亚基），rpoB基因的突变会引起RFP与细菌RNA聚合酶的亲和力降低，导致细菌对RFP耐药[1]。

rpoB基因的突变主要是密码子507到533（RNA聚合酶（rpoB)β-亚单位的81-by）热点区域。

514位和533位密码子突变是引起低水平耐药的常见突变位点。

D516V，H526Y, H526D,S531L，这4个位点的突变是引起高水平耐药的常见突变[2]。

某些密码子突变引起的rpoB基因突变并不会导致细菌对RFP耐药。

本研究利用基因芯片技术对扬州地区结核分枝杆菌RFP耐药基因突变位点特征进行了分析，现报道如下。

大肠埃希菌的鉴定要点和鉴定依据在微生物学的领域中，大肠埃希菌（Escherichia coli，简称 E coli）是一种极为常见且重要的细菌。

准确鉴定大肠埃希菌对于临床诊断、食品安全检测、环境监测等诸多方面都具有至关重要的意义。

接下来，让我们详细探讨一下大肠埃希菌的鉴定要点和鉴定依据。

一、形态学特征大肠埃希菌是革兰氏阴性杆菌，通常呈短杆状，单个或成对存在。

在显微镜下观察，其细胞形态较为规则，两端钝圆。

不过，仅依靠形态学特征来鉴定大肠埃希菌是不够准确的，因为许多其他革兰氏阴性杆菌在形态上与它相似。

因此，形态学特征只能作为初步判断的参考。

二、培养特性1、培养基选择大肠埃希菌在普通营养琼脂培养基上生长良好，形成圆形、凸起、光滑、湿润、半透明的菌落。

在麦康凯琼脂培养基上，大肠埃希菌会形成红色菌落。

2、培养条件适宜的培养温度一般为 37℃，在有氧条件下生长。

3、生化反应特征（1）乳糖发酵试验：大肠埃希菌能发酵乳糖产酸产气，这是其重要的生化特征之一。

（2）吲哚试验：阳性，产生红色反应。

（3）甲基红试验：阳性，呈现红色。

（4）VP 试验：阴性。

（5）枸橼酸盐利用试验：阴性。

这些生化反应的结果综合起来，对于鉴定大肠埃希菌具有重要的参考价值。

三、分子生物学方法1、聚合酶链式反应（PCR）通过设计特异性的引物，对大肠埃希菌的特定基因片段进行扩增。

常用的靶基因包括 16S rRNA 基因、uidA 基因等。

如果 PCR 扩增出预期大小的片段，则提示可能为大肠埃希菌。

2、基因测序对扩增得到的基因片段进行测序，然后将测序结果与已知的大肠埃希菌基因序列进行比对。

如果序列相似度高，则可确定为大肠埃希菌。

四、血清学方法利用大肠埃希菌的特异性抗原，与已知的抗血清进行凝集反应。

如果出现凝集现象，则有助于大肠埃希菌的鉴定。

五、致病性检测某些大肠埃希菌具有致病性，如肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）、肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希菌（EHEC）和肠集聚性大肠埃希菌（EAEC）。