纤维素降解菌

分解纤维素的微生物的分离栾旭东，张兴敏，周雪霞，闫超，何溢涛（山东大学生命科学学院2005级生科基地班，济南250100）摘要：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，它能被土壤中某些微生物分解利用，是因为它们能够产生纤维素酶。

本实验通过从土壤中分离分解纤维素的微生物，初步鉴定了其形态特征和生理生化特性，为日后更进一步的研究打下基础。

关键词：纤维素土壤微生物纯培养刚果红染色法Abstract: cellulose is the most abundant polysaccharide on the earth, which can be digested by some microorganisms in the earth because they produce cellulase. In our experiment, we isolated these microorganisms from the earth and checked up the cells’ and colonies’ morphology and the bioreactions they can act.Key words:cellulose, microorganisms in the earth, pure culture, Congo red staining资源和环境问题是人类在21世纪面临最主要的挑战。

生物质资源是可再生资源，地球上每年光合作用的产物高达 1.5×1011—2.0×1011，是人类社会赖以生存的基本物质资源，其中90%以上为木质纤维素类物质[1]。

目前这部分资源尚未得到充分的开发利用。

随着世界人口迅速增长，矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重要的意义和光明的发展前景。

纤维素降解菌系的筛选及降解稻草条件研究摘要:以已分离的11株纤维素降解菌为材料,采用滤纸崩解法和透明圈法,初步筛选出4株纤维素降解能力较强的菌株｡将这4株单菌进行两两组合,研究混合菌系在9d内的CMC酶活和FPA酶活与单菌发酵之间的异同｡结果表明,混合菌发酵CMC酶活和FPA酶活均优于单一菌株;同时筛选出一组具有高降解能力的混合菌体系;并对该混合菌系降解稻草的最适反应温度､最适初始pH值､产生还原糖的时间进行了研究,结果表明,在30℃､pH值4.5､发酵96 h时混合菌降解稻草的效果最好｡关键词:纤维素降解菌;筛选;CMC酶活;FPA酶活;还原糖含量;降解条件Screening of Cellulose Degrading Microorganism and the Degrading Condition of Rice StrawAbstract: Four strains with strong degradation ability to cellulose materials were screened out of 11 bacteria using filter paper degradation method and clear halo method. Then a mixed germ with higher degradation ability was obtained as the CMC and FPA enzyme activity of mixed bacteria and pure bacterium was compared. The optimum degrading condition of the mixed germ to rice straw was 30℃, pH 4.5, and fermentation for 96 h.Key words: cellulose degrading microorganism; screening; CMC enzyme activity; FPA enzyme activity; degrading condition纤维素是地球上最廉价､最丰富的可再生资源｡全世界每年纤维素及半纤维素的生成量为850亿t｡利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径｡纤维素的生物降解对开辟新能源和防止其污染环境有重要意义,一直是生物技术领域的研究重点[1,2]｡在长期生产实践中发现该生物过程是微生物单独作用不能完成或只能微弱进行的,必须依靠两种或两种以上的微生物共同作用才能完成,微生物混合培养或混合发酵已越来越受重视[3]｡而且国内对产纤维素酶能力较强的单一菌种研究较多,菌种混合发酵的研究较少[4,5]｡本试验在纤维素降解单一菌株研究的基础上,着力于筛选降解纤维素的混合菌系,旨在为纤维素的高效转化提供依据｡1材料与方法1.1菌种纤维素降解菌分别来自枯树根､烂菜叶､牛粪和牛胃中｡1.2培养基制备PDA培养基:马铃薯200 g,蔗糖20 g,琼脂粉20 g,水1 000 mL,pH值6.5｡滤纸条鉴定培养基:(NH4)2SO4 0.10%, KH2PO4 0.10%, MgSO4·7H2O 0.05%,K2HPO4 0.20%,酵母膏0.01%,滤纸条(规格为1 cm×7 cm)1块,pH值6.5｡纤维素刚果红培养基:(NH4)2SO4 0.20%,MgSO4·7H2O 0.05%,KH2PO4 0.10%,NaCl 0.05%,CMC-Na 2.00%,刚果红0.02%,琼脂2.00%,pH值6.5｡液体发酵培养基:KH2PO4 1.00 g, NaCl 0.10 g, MgSO4·7H2O 0.30 g, NaNO3 2.50 g, FeCl3 0.01 g,CaCl2 0.10 g,秸秆木质纤维素20.00 g,pH值7.20~7.40｡1.3菌种初筛透明圈直径(H)与菌落直径(D)比值的测定:将11株保藏菌种(菌种名称分别为N1､N2､N3､N4､N5､N6､N7､N8､N9､N10､N11)活化后分别接种到PDA培养基上,30℃培养3d｡将每一株菌分别转接到纤维素刚果红培养基上,30℃培养4 d后,加入适量1 mol/L的NaCl溶液,浸泡1 h,根据H与D比值的大小进行初筛｡单菌株滤纸失重率的测定:将透明圈大的菌种接种于滤纸条鉴定培养液中,以不接种处理作对照,28℃摇床培养8 d,分别在2､4､6､8 d时测其失重率｡滤纸失重率的测定:用滤纸过滤发酵液,将残留物80℃烘干称重,用减重法计算出滤纸失重率｡失重率=(培养前底物干重-培养后底物干重)×100%/培养前底物干重｡将单菌株滤纸失重率较大且H/D值大于2.0的菌株作为复筛菌种｡1.4复筛将初筛所得单菌种进行两两组合,对单菌种和不同组合菌种测定羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活｡以体积比为1∶1的接种比例､10%的接种量分别接入固态培养基中｡1.4.1羧甲基纤维素酶活测定①酶液的制备:将发酵液于4 000 r/min,4℃,离心20 min,取上清液,备用｡②纤维素酶活力的测定方法(DNS法):取A､B､C共3支50 mL 比色管,在A､B管中分别加入1.5､0.5 mL的1% CMC-Na溶液(用pH值4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液配制)适当稀释的酶液, C管中加入1.5 mL的pH值为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.5 mL酶液,50℃下保温30 min,然后在3支比色管中分别加入2.5 mL的DNS试剂,沸水浴5 min后放入水中冷却,终止反应,定容至25 mL,摇匀,在波长520 nm处测定吸光值(C管作空白对照),并从葡萄糖标准曲线上查出相应的葡萄糖含量,再折算成酶活力单位｡CMC酶活力定义为:在pH值4.8,50℃条件下,1 mL酶液每分钟水解羧甲基纤维素钠生成1 μg葡萄糖的酶量,称为一个酶活力单位,以U/mL表示｡1.4.2滤纸酶活(FPA)测定取A､B､C共3支具塞比色管,在A､B管中加入pH值4.8醋酸-醋酸钠缓冲液1.5 mL和1 cm×6 cm规格的新华滤纸条(约50 mg),50℃下预热10 min后,加入0.5 mL适当稀释的酶液,C管不加底物作空白对照,50℃下保温60 min,然后在3支比色管中分别加入2.5 mL DNS试剂,沸水浴5 min后立即在水中冷却,终止反应,定容至25 mL,摇匀,在波长520 nm处测定吸光值(C管作空白对照),根据葡萄糖标准曲线计算酶活力｡酶活力定义为:在pH值4.8,50℃条件下, 1 mL酶液每分钟水解滤纸条生成1μg葡萄糖的酶量,称为一个酶活力单位,以U/mL 表示｡1.5菌种降解稻草条件研究还原糖含量测定按照DNS比色法[6]进行｡2结果与分析2.1初筛结果由经过活化的11株菌株在刚果红培养基上的生长情况(表1)可知,菌株N1､N2､N3､N7､N8和N9的滤纸失重率相对较高;从透明圈与菌落圈直径之比来看,菌株N1､N3､N7､N8的H/D都超过2.0｡因此,选取N1､N3､N7､N8号菌株作为复筛对象｡2.2复筛结果发酵过程中菌系CMC酶活的变化情况见表2｡由表2可知,接种后1~2 d内酶活逐渐上升,大部分菌株在3~4 d时酶活出现最高峰值,5~6 d酶活开始下降,7~9 d酶活又缓慢上升｡两种菌株混合培养在一定程度上会提高CMC酶活,组合菌株N7+N8培养4 d时的CMC酶活为195.7U/mL,相当于其菌株单独培养平均酶活的2.36倍｡表3表示的是滤纸酶活在发酵过程中的变化情况,总体的变化趋势是在1~4 d 内先上升,5~7 d上升到峰值,之后再下降｡两种菌混合培养时FPA酶活也有一定程度的提高,组合菌株N7+N8在发酵6d时的FPA酶活为30.5 U/mL,相当于其菌株单独培养平均酶活的1.7倍｡因此,选取组合N7+N8作为最优纤维素降解混合菌系｡2.3组合菌株N7+N8降解稻草的最适温度分别研究了温度在20､30､40､50､60℃时混合菌降解稻草后的CMC酶活､FPA 酶活､产还原糖量(表4)｡由表4可知,CMC酶活､FPA酶活､还原糖含量三者之间存在较明显的正相关性,三者均在温度为30℃时达到最大值｡因此选择30℃作为混合菌降解稻草的最适温度｡2.4组合菌株N7+N8降解稻草的最适pH值分别研究了初始pH值为4.0､4.5､5.0､5.5和6.0时混合菌降解稻草后的CMC酶活､FPA酶活､还原糖量｡由表5可知,初始pH值为4.5时,CMC酶活､FPA酶活､还原糖含量三者均达到最大值｡因此选择4.5为混合菌降解稻草的最适初始pH值｡2.5组合菌株N7+N8降解稻草的最适培养时间在混合菌降解稻草的最优发酵条件下,每隔12 h测定1次其生长状况及产糖情况,研究培养时间对混合菌生长及产还原糖的影响,结果见图1｡由图1可知,混合菌系在培养72 h之前,还原糖产量较低,在培养72~96 h过程中,混合菌系迅速产生还原糖,在96 h时还原糖产生量最高,达1.8 g/L｡3讨论本研究筛选出了一组具有较高纤维素降解活力的混合菌系,该混合菌系的CMC 酶活和滤纸酶活均高于单一菌株;同时研究了该混合菌系降解稻草的最适反应温度､最适初始pH值及培养时间对还原糖量的影响｡本研究虽对上述试验条件进行了探讨,但以下问题有待进一步研究:①所得混合菌系纤维素降解酶活力距离生产要求还有很大的差距,应采用诱变等方法对该菌系进行处理,以提高现有菌系的产酶活力;②在利用单因素法研究温度､pH值､培养时间对产酶的影响的基础上,需进一步研究多因素对发酵产酶的影响,以使理论研究更加贴近实际生产｡参考文献:[1] MANDELS M, STERNBERG D. Recent advances in cellulose technology[J]. J Ferment Technol,1976,54(4):267-286.[2] HARUTA S,CUI Z,HUANG Z,et al. Construction of a stable microbial community with high cellulose-degra-dation ability[J]. Applied Microbiology Biotechnology,2002,59(4-5):529-534.[3] 冯树,周樱桥,张忠泽. 微生物混合培养及其应用[J] .微生物学通报,2001,28(3):92-95.[4] 史玉英,沈其荣,娄无忌,等. 纤维素分解菌的分离和筛选[J]. 南京农业大学学报,1996,19(3):59-62.[5] 洪洞,黄秀莉. 纤维素酶的应用[J].生物学通报,1997,32(12):18-19.[6] 王玉万,徐文玉. 木质纤维素固体基质发酵物中半纤维素､纤维素和木质素的定量分析程序[J].微生物学通报,1987,14(2):81-84.。

纤维素分解菌产生透明圈的试剂纤维素是一种在自然界中广泛存在的有机化合物，它是植物细胞壁的主要组成部分，具有结构复杂、稳定性高等特点。

然而，由于其分子结构中含有大量的糖类物质，使得纤维素在自然界中被广泛存在的同时，也具有较高的抗降解性。

这就给微生物降解纤维素带来了一定的困难。

然而，自然界中依然存在着一些能够降解纤维素的微生物，这些微生物产生的酶能够有效地降解纤维素，从而为植物细胞壁的降解提供了可能。

纤维素分解菌是一类具有降解纤维素能力的微生物，它们是自然界中一种重要的生物资源。

纤维素分解菌通过产生一系列的酶来降解纤维素，其中包括纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、木聚糖酶等。

这些酶在纤维素降解的过程中起着非常重要的作用，能够有效地将纤维素降解为小分子的糖类物质。

由于这些酶能够有效地降解纤维素，因此纤维素分解菌在农业、环境保护、能源等领域具有重要的应用价值。

在研究纤维素分解菌的过程中，科学家们发现，纤维素分解菌产生的酶并不是均匀分布在培养基表面的，而是通过产生一定的代谢产物形成了透明圈。

这种透明圈是纤维素分解菌降解纤维素所产生的代谢产物的一种表现形式，透明圈的产生与菌株的降解能力密切相关。

因此，通过观察纤维素分解菌在培养基表面形成的透明圈，可以初步判断纤维素分解菌的降解能力。

为了检测纤维素分解菌产生的透明圈，科学家们设计了一种简单易行的试剂。

根据实验需要，这种试剂能够在不同培养基表面上检测纤维素分解菌所产生的透明圈，从而帮助科学家们确定纤维素分解菌的降解能力。

这种试剂的原理主要基于纤维素分解菌产生的代谢产物对某种化学物质的反应，结合了化学分析与微生物学技术，具有一定的可操作性和准确性。

该试剂的制备方法相对简单，主要包括以下步骤：首先，将所需要的化学物质按一定比例溶解于适量的溶剂中，充分混合并过滤得到所需的试剂。

其次，将该试剂均匀涂抹于培养基表面，然后在试剂处培养纤维素分解菌。

最后，通过观察试剂处的颜色变化或反应产物形成，可以初步判断纤维素分解菌是否产生了透明圈。

纤维素分解微生物的优势与劣势纤维素是一种多糖类物质，广泛存在于植物细胞壁中，是地球上最丰富的有机化合物之一。

然而，纤维素的高度结晶性以及复杂的结构使其难以被生物降解。

为了解决这个问题，科学家们发现了一种能够分解纤维素的微生物，这些微生物在纤维素降解中发挥了重要作用。

本文将探讨纤维素分解微生物的优势与劣势。

1. 优势1.1. 高效降解纤维素纤维素分解微生物具备高效降解纤维素的能力。

它们通过产生纤维素酶来切断纤维素链的β-1,4-糖苷键，将纤维素分解成各种低聚糖和单糖。

这些微生物通常分泌多种纤维素酶，具有对纤维素不同部分的均衡降解能力，从而加速纤维素的降解。

1.2. 有利于资源循环利用纤维素是植物的主要组成成分，在植物生长过程中不断进行合成和分解。

纤维素分解微生物的存在促进了植物纤维素的循环利用。

它们将纤维素分解为低聚糖和单糖，这些产物可被其他微生物进一步利用，形成能源和有机物合成的原料。

1.3. 生态环境的修复和保护纤维素分解微生物在自然界的生态系统中发挥着重要的作用。

它们可以分解植物纤维素，将其释放为二氧化碳和水，促进有机质的降解和循环。

这对于环境中的有机物分解和生态系统的健康发展具有重要影响。

2. 劣势2.1. 竞争与抑制在纤维素分解微生物的群体中，存在着竞争和抑制现象。

不同种类的微生物可能分泌不同类型和数量的纤维素酶，导致彼此之间形成竞争关系，降解效率低下。

同时，某些微生物还可能分泌抑制其他微生物生长的物质，进一步影响纤维素分解的效果。

2.2. 适应性差纤维素分解微生物对环境的适应性相对较差。

在不同的环境条件下，纤维素分解微生物的降解效率和能力可能存在差异。

温度、pH值等环境参数的改变都会对纤维素分解微生物的生长和降解能力产生影响，限制了其应用范围。

2.3. 有害代谢产物的产生纤维素分解微生物在降解纤维素的过程中会产生一些有害的代谢产物，如酸性物质和气味较大的挥发性物质。

这些产物对周围环境和生物体可能造成潜在的负面影响，需要进一步处理和管理。

牛粪中纤维素降解菌的分离和纯化（河西学院生命科学与工程系）摘要:本实验利用纤维素为唯一碳源从牛粪中分离纯化纤维素降解菌。

先通过在振荡培养箱中饥饿处理2-3d，静置后取上清液接入刚果红培养基于35℃-37℃下富集培养2-3d，再经刚果红培养基划线培养，获取单菌落，经菌落及菌体形态观察，确定此纤维素降解菌为放线菌。

关键词: 纤维素降解菌；刚果红培养基；牛粪The dung of cellulose degradation bacterium separation andpurificationChen Mengen Deng Haibo Liu Panpan Zhao Yongjiao(Hexi university life science and engineering)Abstract: Collecting dung from zhang ye peasant diluted appropriate in oscillation incubator with hunger in 2-3d, quiet place take supernatant access Congo red training based on 35 c - 37 ° c, 2-3d enriched by Congo Red Cross cultureLine, for single colonies, appraisal of classics the cellulose degradation bacterium actinomycosis.Key words: cellulose degradation bacterium,Congo red medium, The dung 全世界每年大约形成 1.0×1012～2.0×1012植物有机物质 ,其中有一半是纤维素物质 .我国每年仅农业生产中形成的农作物残渣 (稻草、秸秆等 )就约有 7亿ｔ,工业生产中还有数百万吨的纤维素废弃物 .这些废弃物即没有得到充分的利用 ,又污染环境 ,因此合理开发和科学利用这一丰富的自然资源，具有极其重要的意义和光明的发展前景。