电子克隆技术及其在植物基因工程中的应用

电子克隆技术及其在植物基因工程中的应用王冬冬，朱延明＊，李勇，李杰，柏锡

（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨１５００３０）摘要：电子克隆是随着基因组计划和ＥＳＴ计划的实施而发展起来的，是利用生物信息学手段进行基因克隆

的新方法。它具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点。因此，电子克隆技术必将成为植物基因工程中获得新基因的重要手段。阐述了电子克隆应用所依据的数据库与生物信息资源，介绍了利用电子克隆获得功能基因的方法，及其在植物基因工程中的应用现状与前景。关键词：电子克隆；植物基因工程；表达序列标签ＥＳＴ；生物信息学

中图分类号：Ｑ７８５；Ｑ９４３．２文献标识码：Ａ

收稿日期：２００５－０１－１４基金项目：国家自然科学基金（３０４７１０５９）

作者简介：王冬冬（１９８１－），女，黑龙江人，硕士研究生，研

究方向为植物分子生物学与植物基因工程。＊通讯作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｍｚｈｕ２００１＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ

电子克隆（ｉｎｓｉｌｉｃｏｃｌｏｎｉｎｇ）是近年来伴随着基因组计划和ＥＳＴ计划发展起来的基因克隆新方法。电子克隆的技术原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力，通过ＥＳＴ或基因组的序列组装和拼接，利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法快速地获得新基因。国际上Ｂｏｇｕｓｋｉ等学者在１９９４年开始利用电子克隆方法发现新基因，中国科学院生物物理研究所陈润生研究组在１９９６也开始了对电子克隆的研究［１］。电子克隆技术应用的前提条件要具备拟研物种的丰富核酸序列信息，其他物种的相关基因的信息，以及强大的计算机硬件和相关生物信息学分析软件。基因组和ＥＳＴ资料的丰富程度决定了电子克隆得以在人类、小鼠等生物中广泛应用。由于受到序列资料的限制，植物基因的电子克隆还鲜有报道。但随着植物基因组计划和功能基因组学的发展，电子克隆在植物基因工程研究中必将发挥出巨大的功用。１电子克隆技术及其依托的生物信息学资源１．１电子克隆的基本原理利用电子克隆方法获得新基因是生物信息学的研究内容之一。生物信息学资源是由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成。而电子克隆的应用即是基于这三部分生物信息学资源而展开的。它是利用计算机技术，依托现有的网络资源（ＥＳＴ数据库、核苷酸数据库、蛋白质数据库、基因组数据库等），采用生物信息学方法（包括同源性检索、聚类、序列拼装等），通过ＥＳＴ或基因组的序列组装和拼接，利用ＲＴ－ＰＣＲ快速地获得部分乃至全长ｃＤＮＡ序列的方法。

１．２电子克隆的实施方案首先，在数据库或ＰｕｂＭｅｄ中获得感兴趣的ｃＤＮＡ或氨基酸序列，基于ＥＳＴ和基因组信息两种

数据资源，利用上述得到的已知基因序列实施电子

克隆有以下两种方案。利用ＥＳＴ数据库信息资料：①利用序列同源性比较软件（如Ｂｌａｓｔ软件）将种子序列对库检索；②从数据库中挑选出全部相关序列；③对所有序列

进行片段整合分析（即Ｃｏｎｔｉｇ分析），形成延伸后的序列，称新生序列。随后，将此新生序列作为种子序列重复进行上述三步过程，直至新生序列不能被进一步延伸为止，通过完整性分析即获得了全长的新基因序列［２－３］。见图１。

利用基因组信息资料：把作为信息探针的氨基酸或核苷酸序列在ＮＣＢＩ网站中对特定物种各基因组数据库进行ＢＬＡＳＴ分析，从结果中筛选出感兴趣的外显子序列，并通过链接得到其所在的基因组

序列，同时根据比对的结果对基因组序列可能造成的移码测序错误进行修正；把这些感兴趣的外显子

第３７卷第３期东北农业大学学报３７（３）：４０３￣４０８２００６年６月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＪｕｎｅ２００６

文章编号１００５－９３６９（２００６）０３－０４０３－０６󰀠󰀠󰀠󰀠󰀠󰀠󰀠󰀠󰀠󰀠

󰀠󰀠󰀠󰀠󰀠󰀠

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󰀠感兴趣的ＥＳＴ序列相似的ＥＳＴ片段序列重叠群（ｃｏｎｔｉｇ）不能再延伸的Ｃｏｎｔｉｇ

获得全长ｃＤＮＡ序列ＲＴ－ＰＣＲ、克隆、测序、功能鉴定

Ｂｌａｓｔ（ｄｂＥＳＴ）聚类，拼接，延伸重复Ｂｌａｓｔ

分析完整性

感兴趣的外显子序列及基因组序列ｃｏｎｔｉｇ或ＢＡＣ／ＰＡＣ克隆

获得其侧翼基因组序列外显子预测，拼接可能的新基因序列获得基因全长序列ＲＴ－ＰＣＲ、克隆、测序、功能鉴定

分析完整性

序列按照其所在基因组上的位置依次进行直接连接，或者把基因组序列提交到ＧｅｎＳｃａｎ和ＧｅｎｅＦｉｎｄｅｒ等网站进行预测，得到可能的新基因序列。有时各外显子分别处于较短的尚未组装的基因组序列中，也可按探针基因外显子顺序进行直接拼接；把可能的新基因序列基于核酸数据库做ＢＬＡＳＴ分析，检验其新颖性；把筛选后的新基因序列提交到ｄｂＥＳＴ数据库做ＢＬＡＳＴ分析并延伸，同时也是进一步确认其真实存在的可信度，并进行组织表达定位，为克隆该基因提供组织来源信息。最后根据最终的序列设计引物，进行ＲＴ－ＰＣＲ实验得到新基因［４］。见图２。

图１基于ＥＳＴ数据库的电子克隆流程Ｆｉｇ．１ＳｉｌｉｃｏｃｌｏｎｉｎｇｆｌｏｗｂａｓｅｄｏｎＥＳＴｄａｔａｂａｓｅ图２基于基因组数据库的电子克隆流程

Ｆｉｇ．２Ｓｉｌｉｃｏｃｌｏｎｉｎｇｆｌｏｗｂａｓｅｄｏｎｇｅｎｏｍｅｄａｔａｂａｓｅ

１．３电子克隆依据的网络分析程序和应用软件１．３．１序列的相似性检索分析程序一条序列对整个数据库进行相似性分析以发现其同源序列是电子克隆中的一个极其重要的方面。目前使用最广泛的程序是ＦＡＳＴＡ和ＢＬＡＳＴ。ＦＡＳ－ＴＡ集中反映具有显著意义的序列对齐结果。在互联网上已有许多的在线ＦＡＳＴＡ查找服务，同时也可下载后离线使用，下载站点：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｖｉｒ．ｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｆａｓｔａ／ｄｏｓ／。ＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ，基本局部比对搜索工具）则采用了一种短片段匹配算法和一种有效的统计模型来找出目的序列和数据库之间的最佳局部对齐效果。目前在互联网上有许多在线的ＢＬＡＳＴ查找程序，专门用于查找各大数据库中与用户提交的序列同源的序列，如：ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ）和ＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｂｌａｓｔ２）和ＥＢＩ的ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｆａｓ－ｔａ３３／）。同时运行这两个程序进行数据分析，能避

免漏检一些有用的信息［５－６］。１．３．２序列拼接、聚类的软件

序列拼接、聚类常用的软件或软件包见表１［７］。１．３．３核酸序列分析预测程序及软件

１．３．３．１可读框架（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）分析ｍＲＮＡ需要翻译为蛋白质方能发挥其生物学作

用。因此，核酸序列的可读框架分析是核酸分析的一个重要部分。基于遗传密码表，可通过计算机方便的分析核酸序列的读码框。最常用的互联网ＯＲＦ分析资源是ＮＣＢＩ提供的ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ，网址是

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ。

１．３．３．２基因序列中的编码区／内含子结构分析预测通过与数据库中已知的蛋白质序列、ｃＤＮＡ序列以及ＥＳＴ序列进行对比，可识别编码区和内含子、外显子剪接位点。一些内含子和外显子数据库可供参考，例如ＩＤＢ（

ｈｔｔｐ：／／Ｎｅｔｍｅｇ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅ－

・４０４・东北农业大学学报第３７卷软件／软件包名称Ｎａｍｅｏｆｔｈｅｓｏｆｔｗａｒｅｏｒｓｏｆｔｗａｒｅｐａｃｋａｇｅ功能描述Ｆｕｎｃｔｉｏｎｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ获取方式Ｏｂｔａｉｎｅｄｗａｙ

ＵｎｉＧｅｎｅＧｅｎｅＢａｎｋ中的ＥＳＴ序列按照基因簇分类结果ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／

ＧＡＰ４进行序列拼接，检查分析结果等功能

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ．ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂｓｅｑ／

ｍａｎｕａｌ／ｇａｐ４－ｕｎｉｘ－ｔｏｃ．ｈｔｍｌ

ＳＴＡＣＫＰＡＣＫ包含ｃｒｏｓｓ－ｍａｔｃｈ，ｄ２－ｃｌｕｓｔｅｒ，ｐｈｒａｐ，ＣＲＡＷ对序列进行质量控制，拼接等ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｂｉ．ａｃ．ｚａ／Ｄｂａｓｅｓ．ｈｔｍｌ

ＣＡＰ３对序列进行质量控制和拼接ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｓ．ｍｔｕ．ｅｄｕ／ｓａｓ．ｈｔｍｌＴＩＧＲＡｓｓｅｍｂｌｅｒ序列拼接ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ａｓｓｅｍｂｌｅｒ／ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒＴＭ查看测序峰图，序列校正、序列拼接ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃｏｄｅｓ．ｃｏｍ

Ｓｔａｄｅｎｐａｃｋａｇｅ包含ｇａｐ４，ｃａｐ３，ｔｒｅｖｐｒｅｇａｐ４，ｓｐｉｎ等程序可对序列进行质量控制，拼接等，并图形化显示结果ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ．ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ，ｕｋ／ｐｕｂｓｅｑ／

ｓｔａｄｅｎ－ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ

Ｂｌａｓｔｃｌｕｓａｔ对核酸或蛋白序列进行聚类

ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓ／

（Ｂｌａｓｔｃｌｕｓａｔ包含在ｂｌａｓｔ软件包中）

ｄｕ／ｉｎｔｒｏｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）；ＥｘＩｎｔ（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｔｒｏｎ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ）。也可通过ＧＥＮＥＳＣＡＮ（ｈｔｔｐ：／／２１１．１６１．１９６．２１４：８８８８）程序预测基因组序列中可能的外显子；利用ＧｅｎｅＦｉｎｄｅｒ软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｏｒｇ／ｕｒｌｌｉｓｔｓ／ｇｅｎｅｆｉｎｄ．ｈｔｍｌ）进行基因组序列的内含子和外显子分析。１．３．３．３基因启动子及其他ＤＮＡ调控位点分析预测基因启动子分析预测常用的数据库有真核生物启动子数据库ＥＰＤ（ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＰｒｏｍｏｔｅｒＤａｔａｂａｓｅ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｄ．ｉｓｂ－ｓｉｂ．ｃｈ／。植物启动子数据库ＰｌａｎｔＰｒｏｍＤＢ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｂｅｒｒｙ．ｐｈｔｍｌ？ｔｏｐｉｃ＝ｐｌａｎｔｐｒｏｍ＆ｇｒｏｕｐ＝Ｄａｔａ＆ｓｕｂｇｒｏｕｐ＝ｐｌａｎｔｐｒｏｍ；转录起始位点预测工具ＮＮＰＰ（ＮｅｕｒａｌＮｅｔｗｏｒｋＰｒｏ－ｍｏｔｅｒＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ．ｈｔｍｌ，ＰＲＯＳＣＡＮ：ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｐｒｏｓｃａｎ，ＰｌａｎｔＰｒｏｍＤＢ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｆ－ｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｂｅｒｒｙ．ｐｈｔｍｌ？ｔｏｐｉｃ＝ｐｌａｎｔｐｒｏｍ＆ｇｒｏｕｐ＝ｄａ－ｔａ＆ｓｕｂｇｒｏｕｐ＝ｐｌａｎｔｐｒｏｍ；植物顺式作用元件分析工具ＰＬＡＣＥ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｈｔｄｏｃｓ／ＰＬＡＣＥ／［５］。１．３．４蛋白质序列分析预测程序及软件１．３．４．１蛋白质基本性质分析位于ＥｘＰＡＳｙ的ＰｒｏｔＳｃａｌｅ程序（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘ－ｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ．ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）可被用来计算蛋白质的疏水性图谱。进行蛋白质的亲／疏水性分析时，也可使用一些Ｗｉｎｄｏｗｓ下的软件资源，如ＢｉｏＥｄｉｔ、ＤＮＡＭＡＮ等。跨膜区的分析利用网上的相关软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ．ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ），该程