植物基因转化及转基因植物地分析报告与鉴定
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植物病理学中的抗病基因筛选与转基因抗病品种培育植物病理学是研究植物疾病的发生、发展和防治的学科。
抗病基因在植物病理学中起着重要作用,它们能够为植物提供抗病性,减轻植物受病害侵袭的程度。
对于农作物来说,培育抗病品种是实现农业可持续发展的重要途径之一。
本文将从抗病基因筛选和转基因抗病品种培育两个方面展开探讨。
一、抗病基因筛选抗病基因的筛选是培育抗病品种的前提。
通过筛选和鉴定抗病基因,可以为后续的转基因培育提供基础。
目前,抗病基因筛选主要采用两种方法:传统方法和现代生物技术方法。
1. 传统方法传统方法是指对不同品种的植物进行交配、选育,并通过后代的表现来判断其抗病性。
这种方法主要依赖于人工选择和观察的经验。
例如,在番茄品种中,通过选育具有抗番茄黄色叶病毒(ToLCNDV)的亲本,再进行交配和杂交,最终获得抗病的番茄品种。
然而,传统方法存在着一些局限性,如耗时、成本高、效率低等问题。
2. 现代生物技术方法现代生物技术方法使抗病基因的筛选更加高效。
其中,分子标记辅助选择技术和全基因组关联研究是主要的方法。
分子标记辅助选择技术通过分析与抗病基因相关的DNA标记,可以准确预测植物的抗病性。
全基因组关联研究则是通过测定大量的遗传标记与表型(抗病性)之间的相关性,来鉴定抗病基因。
这些技术使得抗病基因的筛选更为精准、高效。
二、转基因抗病品种培育转基因技术是指通过外源基因的导入和表达,使植物表现出特定的性状,从而达到培育抗病品种的目的。
转基因抗病品种培育经历了以下几个步骤:1. 基因克隆和基因功能验证首先,从抗病品种中克隆并鉴定出具有抗病功能的基因。
通过基因克隆的技术手段,如PCR、基因组文库等,将具有抗病性的基因分离出来,并进行功能验证。
这一步骤的目的是确保转入的基因具有预期的抗病效果。
2. 基因转化通过农杆菌介导、基因枪等方法,将已经验证过功能的抗病基因导入到植物细胞中。
植物细胞会通过自身的复制和分化过程,形成具有转基因抗病基因的植株。
植物遗传转化步骤植物遗传转化是指通过外源DNA的导入,使植物细胞或组织发生基因改变,从而获得具有特定性状的转基因植物。
这一技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用。
下面将介绍植物遗传转化的基本步骤。
步骤一:选择外源DNA在植物遗传转化中,首先需要选择外源DNA,也就是我们要导入到植物细胞中的目标基因。
这个目标基因可以来自于其他物种,也可以是人工合成的。
目标基因的选择取决于我们希望在转基因植物中表达的特定性状。
步骤二:构建转化载体将目标基因导入植物细胞需要使用载体。
载体是一种专门设计用于植物遗传转化的DNA分子。
通常,载体由多个组成部分组成,包括启动子、终止子、选择标记和目标基因。
这些组成部分的功能是确保目标基因能够在植物细胞中正确表达。
步骤三:转化载体导入植物细胞一旦构建好转化载体,接下来就需要将其导入到植物细胞中。
目前,有多种方法可以实现这一步骤,包括农杆菌介导转化、基因枪法和电穿孔法等。
这些方法都可以有效地将外源DNA导入植物细胞,使其成为转基因细胞。
步骤四:筛选转基因细胞一旦植物细胞被导入外源DNA,我们需要对其进行筛选,以确定哪些细胞成功地获得了目标基因。
为了实现这一步骤,常常会在转化载体中加入选择标记基因,如抗生素抗性基因。
只有携带了目标基因的细胞才能存活下来,而其他细胞则会被筛选掉。
步骤五:培养和再生转基因植物筛选出的转基因细胞可以通过培养和再生来获得完整的转基因植物。
这一过程通常需要在培养基上进行,通过提供适当的营养物质和激素来促进细胞分裂和分化。
经过一段时间的培养,转基因细胞可以发展成为转基因植物。
步骤六:鉴定转基因植物需要对获得的转基因植物进行鉴定,以确认其是否成功地获得了目标基因。
这一步骤通常需要使用分子生物学技术,如PCR和Southern blot等,来检测目标基因的存在和表达。
只有经过鉴定的转基因植物才能用于进一步的研究或应用。
总结:植物遗传转化是一项复杂的技术,需要经历多个步骤才能成功。
gus报告基因GUS报告基因。
GUS报告基因是一种用于植物基因表达研究的重要工具。
它是由β-葡萄糖苷酶(β-glucuronidase)基因构建而成,可以被广泛地应用于植物遗传转化和表达分析中。
GUS报告基因的研究对于理解植物基因表达及其调控机制具有重要意义。
首先,GUS报告基因可以用于植物遗传转化的研究。
通过将GUS报告基因导入植物细胞,可以观察到该基因在植物体内的表达情况。
这对于研究外源基因在植物中的表达特点以及转基因植物的遗传稳定性具有重要意义。
通过对GUS报告基因的研究,可以更好地了解植物转基因技术的应用前景及其潜在风险。
其次,GUS报告基因也可以用于植物基因表达分析。
通过将GUS报告基因与目标基因进行融合,可以观察到目标基因在植物体内的表达情况。
这对于研究目标基因在不同组织和发育阶段的表达模式,以及其受到外界环境因素影响的调控机制具有重要意义。
通过对GUS报告基因的研究,可以更好地了解植物基因表达调控的分子机制及其在植物生长发育过程中的作用。
此外,GUS报告基因还可以用于植物转基因技术的研究与应用。
通过对GUS报告基因的表达情况进行定量和定位分析,可以更好地评估转基因植物的表达效率和稳定性。
这对于改良转基因植物的遗传背景和表达性能具有重要意义。
通过对GUS报告基因的研究,可以更好地指导植物转基因技术的开发和应用,为农业生产和生物技术研究提供有力支持。
综上所述,GUS报告基因在植物基因表达研究中具有重要的应用价值。
通过对GUS报告基因的研究,可以更好地理解植物基因表达及其调控机制,促进植物遗传转化和基因功能研究的进展,为植物生物技术的发展和应用提供重要支持。
因此,对GUS报告基因的深入研究具有重要的理论和实际意义,值得进一步深入探讨和应用。
白豌豆的遗传转化与基因功能验证白豌豆(Pisum sativum),作为一种重要的农作物和园艺植物,广泛种植于全球各地。
在农业生产中,白豌豆的耐逆性、抗病性等基因功能非常重要。
为了更好地改良白豌豆的性状并提高产量,科学家们不断进行白豌豆的遗传转化与基因功能验证研究。
遗传转化是指在基因工程中将外源基因导入到目标植物中,从而改变其遗传特性的过程。
对于白豌豆来说,遗传转化技术有助于引入具有特定功能的基因,以提高其抗病性、耐逆性等重要性状。
首先,科学家们必须确定适合用于白豌豆的遗传转化方法。
目前常用的方法包括农杆菌介导的基因转化和生物物理手段导入基因等。
在农杆菌介导的基因转化中,科学家们将目标基因组插入细菌Agrobacterium tumefaciens,然后将其转移到白豌豆的组织中。
而生物物理手段则包括基因枪法和电穿孔法等,通过物理力量将外源DNA直接导入到白豌豆的细胞中。
一旦成功进行了遗传转化,接下来的关键是验证导入基因的功能是否有效。
基因功能验证是判断转基因植物是否具有期望性状的过程。
对于白豌豆来说,基因功能验证可包括对抗病性、耐逆性等性状的研究。
抗病性是农作物育种中非常重要的性状之一。
通过基因转化技术,科学家们可以引入具有抗病性基因的DNA到白豌豆中。
在基因功能验证中,科学家们需要利用不同的病原体进行感染实验,观察转基因白豌豆的抗病能力。
这些病原体可能包括细菌、真菌等,可以是常见的白豌豆病原体,也可以是其他农作物病原体。
通过观察转基因白豌豆的抗病程度和病症表现,可以评估引入基因是否有效。
耐逆性是另一个重要的基因功能。
白豌豆在生长过程中会面临各种环境胁迫,如干旱、高温等。
通过基因转化技术,科学家们可以导入一些耐逆性基因,帮助白豌豆在恶劣环境中生长和发育。
基因功能验证中,科学家们可以对转基因白豌豆和野生型白豌豆进行比较实验,观察它们在干旱和高温等胁迫条件下的表现。
通过测量生长指标、叶绿素含量、抗氧化酶活性等参数,可以评估转基因白豌豆的耐逆性。
基因工程实验报告引言基因工程是现代生物技术的一个重要分支,通过对生物体基因的修改和重组,可以创造出具有特定功能的生物体。
本次实验旨在探究基因工程在农业、医学等领域的应用,以及可能带来的潜在风险和争议。
实验方法1. 筛选目标基因:首先,我们在实验中选择了对叶绿体功能有重要影响的一个基因作为目标基因。
2. 基因克隆:通过PCR技术,将目标基因从细菌DNA中放大,然后将其插入载体DNA中。
3. 转化目标生物体:将重组的载体DNA转入植物叶片细胞中,借助几丁质体、热激冲击等方法促使基因转化成功。
4. 筛选阳性转化率:通过筛选培养基中的抗性选择制剂,筛选出转化成功的阳性细胞。
5. 验证目标基因的表达:通过PCR扩增和基因芯片技术验证目标基因在转化植物中的表达情况。
实验结果1. 实验结果显示:我们成功将目标基因插入到植物叶片细胞的染色体中,并且获得了一定比率的阳性转化植株。
2. 鉴定转化植株:对转化植株进行证实鉴定,确保目标基因已经整合到植株基因组中,且稳定表达。
3. 表达验证:通过PCR扩增和基因芯片分析,确定目标基因在转化植物中得到了表达,并且表达量较高。
4. 性状鉴定:对转化植物进行生长发育、形态结构、生理生化等方面的综合性状鉴定,结果显示转化植物与野生型无显著差异。
讨论基因工程技术的应用:本次实验展示了基因工程技术在农业生产中的应用前景,通过将具有耐逆性、抗病虫害等功能基因导入植物,可以提高植物的产量和抗逆性。
潜在风险和争议:但是,基因工程也伴随着一系列争议和风险,如转基因植物可能对环境造成影响,转基因食品可能对人体健康产生潜在影响,因此需要严格的监管和评估。
结论通过本次实验,我们成功地验证了基因工程技术的可行性,展示了其在农业和生命科学领域的广阔应用前景。
然而,我们也要看到基因工程技术所带来的潜在风险和争议,需要谨慎评估和监管。
基因工程是一把双刃剑,只有正确使用才能实现其最大的利益。
愿基因工程技术为人类带来更多福祉。
竭诚为您提供优质文档/双击可除转基因筛选实验报告篇一:转基因小鼠鉴定实验转基因小鼠鉴定实验在刚出生产出的鼠仔中,属转基因小鼠者,约占全部仔小鼠的20%-30%。
因此,对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。
1.转基因整合检测鉴定转基因小鼠最简单的方法是从小鼠尾尖提取基因组DnA,检测其基因型。
检测方法包括pcR和shouthern杂交。
(1)基因组DnA的提取:1)将离乳期小鼠(>4周龄)麻醉标记。
2)用一只手抓住小鼠,另一只手持消毒剪剪下约1cm 的鼠尾。
(2)pcR检测:转基因的初始筛选通常采用pcR检测技术。
该技术操作简便、快速、费用低而有效,适合大量标本的分析。
由于该技术特别敏感,可能产生假阳性结果。
因此,在操作过程中必须特别小心,避免质粒DnA或其它标本的基因组DnA的污染。
假阳性的产生对转基因小鼠的筛选工作将是致命的。
pcR实验应采用双复管,甚至三复管。
阳性结果最好用southern杂交技术进一步证实。
(3)southernblot分析:该技术虽然没有pcR技术那样敏感,且费力费时,但是避免了因污染导致假阳性结果的麻烦,可以得到目的基因整合后的基因组、整合位点数目、转基因拷贝数等的确切信息。
southernblot的实验操作参见第一章的第八节。
2.转基因表达检测转基因整合检测是确定目的基因是否整合到了小鼠的基因组中,同时可确定整合的位点和拷贝数,这在遗传学上是十分重要的。
而转基因表达检测是确定目的基因在转基因小鼠器官组织中表达的时空分布。
其检测包括RnA分析技术和蛋白质检测技术。
篇二:转基因技术综述动物转基因技术研究进展及其应用前景孙凤俊张佳谊韩广文(北京奶牛中心北京延庆102100)摘要:转基因技术作为生命科学的前沿技术之一,已经逐渐走入了人们的生活。
转基因技术可以认为是在一定程度上通过科学技术手段让其他生物、植物朝着对人类有利方向发展的技术。
本文介绍了转基因技术及其应用研究现状,并预测了未来发展前景,阐述了该技术的利弊关系,指出只有通过正确的引导和规范管理,才能很好地利用该技术,使它为人类服务。
农杆菌转化法及转基因植物检测方法摘要:近年来,植物基因工程技术飞速发展,转基因植物在很多领域的研究推广取得了令人瞩目的成绩。
植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。
另外,转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进歩和完善,目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类:整合水平上的检测、转录水平上的检测和表达水平上的检测。
本文着重对农杆菌介导的植物转化方法和转基因植物的检测两方面进行综述。
关键词:农杆菌,转化,转基因植物,检测方法伴随着生命科学的飞速发展,植物组织培养技术以及植物组织分化、植物基因重组等技术发展迅速并得到广泛应用。
1984年转基因烟草的诞生[1],使外源基因导入植物细胞从而获得转基因新品种的设想成为现实。
随后,转基因技术被广泛应用于各个方面如:植物新品种的改良、植物性状改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等[2-4]。
新型转基因大豆、转基因番茄及转基因玉米等转基因新品种陆续面世[5]。
植物转基因技术不但能够打破植物的物种界限,还能够使物种基因彼此进行交流。
使植物育种年限缩短,植物育种进程加快,植物抗性也在一定程度上得到很大提高,使来自于不同生物种类的优良目的基因导入植物并得到优良植物新品种。
同时,运用转基因技术研究植物自身基因结构组成及其基因功能调控等方面也取得了一定成果;运用转基因技术还研制出生物反应器和雄性不育系[6]。
目前,利用转基因技术将目的基因导入植物基因组中的常用方法主要有:土壤农杆菌介导的基因转化、DNA直接导入和植物病毒系统介导法。
本文着重介绍土壤农杆菌介导的目的基因转化法,同时也对目前转基因植物的检测进行适当总结。
1 土壤农杆菌介导系统的种类土壤农杆菌中的发根农杆菌和根癌农杆菌能够侵染植物伤口并形成与土壤农杆菌中大质粒有关的植物肿瘤和冠瘿。
能够诱发此类肿瘤的根瘤农杆菌中常常带有分子量为200-250kb的Ti质粒。
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
转基因作物安全评价及检测技术自从1983年首例抗病毒转基因作物(GMC)问世以来,转基因作物的开发就成为了科学界研究的热点。
1986年,转基因作物首次被批准在田间试验,1993年底,美国的第一批延迟成熟期番茄获得上市批准。
其后,转基因作物的发展更为迅速。
截止1997年10月,全世界转基因作物的田间试验已达25000多例,开发了具有抗除草剂、抗虫、抗病毒、延长成熟期等不同性状的转基因油菜、玉米、棉花、水稻、番茄、南瓜等新品种。
近年来,各国在原有的转基因作物研究基础上取得了大量成果,除了上述的抗虫、抗除草剂以及抗病毒作物外,还出现了氮、磷肥高效利用,耐旱、耐盐碱、耐铝毒等转基因作物,蒸煮和食味品质明显改善的水稻及富含昏胡萝卜素的…金米”稻等。
2007年,张启发院士提出开展“绿色超级稻”培育的构想。
重点围绕水稻抗病虫、抗旱、营养高效利用、优质、高产等五大重要性状进行改良,使水稻生产实现“少打农药、少施化肥、节水抗旱、优质高产”。
基于转基因作物优良的特性,越来越多的国家批准转基因作物的商业化种植。
据国际农业生物技术应用服务组织f ISAAA)统计,2009年全球共有25个国家种植转基因作物,种植面积达到1.34亿hm2。
是1996年的80倍,全球市场价值达到105亿美元。
目前商业化种植的主要转基因作物是大豆、玉米、棉花和油菜等,其中转基因大豆和玉米的种植面积占全球转基因作物种植面积的80%以上。
我国目前主要种植的是转基因棉花、杨树、番茄和甜椒等,种植面积从2002年的200万hm 2增加到2009年的370万hm2,年均增长15%。
2009年我国抗虫转基因棉花种植面积约占总种植面积的90%,转基因棉花的广泛种植有效的降低了棉花种植成本,给我国带来了巨大的经济效益。
2009年12月,我国又为转植酸酶基因玉米和两个转基因抗虫水稻品系“华恢1号”和“Bt汕优63”颁发了生物安全证书,使转基因玉米和水稻的商业化进程向前迈进了一大步。
转基因植物的生物学检测获得了分子水平上经DNA 整合及表达检测证实的转基因植株后,在遗传学水平上还存在着更深层次的问题,即转基因植株是纯合体还是杂合体?在遗传过程中是否出现分离?这就涉及转基因植株的遗传稳定性。
因此,在获得转基因材料的同时要进行纯合体的鉴定。
纯合体的获得是进一步研究和利用转基因材料的前提。
此外,转基因后代存在遗传多样性的问题,加强对转基因功能植物主要性状和遗传多样性评价,不断挖掘转基因植物种质资源遗传信息,对促进植物种质资源创新和培育综合性状优良品种具有重要意义。
利用分子标记技术进行遗传多样性检测是行之有效的手段。
判定转基因植物还需要提供外源基因控制的表型性状(如抗性)及这种表型性状的遗传稳定性等证据,即外源基因的导入是否真正发挥了作用,这种功能是否能稳定遗传,使作物在某一方面的性状得以提高。
本节包括转基因植株外源基因纯合和嵌合基因体检测、遗传多样性检测、目的性状检测及遗传稳定性检测等4部分内容。
一、转基因植株外源基因纯合和嵌合基因体检测1.转基因植株外源基因纯合体检测转基因作物在全世界已广泛种植,在转基因植株的利用中,外源基因的快速纯合是育种利用的必要前提。
因此,区分转基因后代植株是杂合体还是纯合体很有必要。
在遗传学中,纯合体又称同型合子或同质合子,是指由两个基因型相同的配子所结合而成的合子,也指由此种合子发育而成的生物个体。
纯合体的同源染色体,在其对应的一对或几对基因座位上存在着完全相同的等位基因,如AA、aa、AABB、AAbb、aaBB、AABBcc、aaBBcc等,具有这些基因型的生物,就这些成对的基因来说,都是纯合体。
在它们的自交后代中,这几对基因所控制的性状不会发生分离。
杂合体又称异型合子或异质合子,是指由两个基因型不同的配子结合而成的合子,也指由此种合子发育而成的生物个体。
杂合体的同源染色体,在其对应的一对或几对基因座位上存在着不同的等位基因,如Aa、AaBb、AaBbCc 等,具有这些基因型的生物,就这些成对的基因来说,都是杂合体。
实用文档 文案大全 植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1. 了解创建烟草突变体库的方法; 2. 理解每种方法的基本原理; 3. 掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。 〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成,在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容,在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上,传统方法是使用物理或化学诱变方法获得,其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比,生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因,从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年,通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物,其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容,其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础,也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养,使烟草产生愈伤组织,利用土壤农杆菌感染愈伤组织,实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人,利用植物细胞的全能性,经过抗性筛选,诱导分化,从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株,获得各突变体的纯合材料,从而建立烟草突变体的数据库,然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系,存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列,用其作探针筛选基因文库,获取目标基因或克隆,再进行下一步的分析(图实验4-1)。
T-DNA 载体构建
转化植物(T1,T-DNA杂合子)收获T2种子 实用文档
文案大全 筛选T2,获突变子,应为3:1分离
确定T-DNA与突变型共分离的个体 产生纯合后代 克隆T-DNA两侧的植物DNA(Tail PCR) 利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证(遗传互补测验,分离的野生基因转化突变体,回复功能) 图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程 TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物(根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物,Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物(AD,Tm值44-46℃)组合,以突变体基因组DNA为模板,进行多次PCR反应,采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法,最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段(实验图4-2),可作为探针,筛选分离基因。 TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景,同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段,与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点,已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。 实用文档
文案大全 实验图4-2 TAIL-PCR反应流程图 本实验用含T-DNA载体质粒pCAMBIA1301的LBA4404农杆菌菌株转染烟草愈伤组织,让T-DNA随机插入烟草的基因组中形成T-DNA突变体,通过PCR特异扩增HPT基因片段来鉴定转基因烟草, 以TAIL-PCR法获得转基因烟草突变体的侧翼基因片段,测序后将获得侧翼基因片段的序列与GeneBank中的已知序列对比,获得功能基因的全序列。
〖仪器、材料和试剂〗 (一)仪器
高速冷冻离心机,PCR仪,超净工作台,恒温摇床,隔水式恒温培养箱,光照培养箱,紫外可见分光光度计,凝胶成象仪或Dark Reader,恒温水浴锅,微孔加热器,电泳仪,水平板电泳槽,天平,酸度计,旋涡混合器。 实用文档 文案大全 (二)材料 烟草幼苗,含T-DNA载体质粒pMD83rc的LBA4404农杆菌菌株,Ex-taq DNA 聚合酶,DNA 1kb laddeer,GoldView核酸染料。
(三)试剂 1. 2×CTAB提取液 100mmol/L Tris-HCl pH8.0 2%(w/v)CTAB 1.4mol/L NaCl 40mmol/L b-巯基乙醇 20mmol/L EDTA 2. TE缓冲液 10mmol/L Tris-HCl pH8.0 1mmol/L EDTA
3. 50´TAE电极缓冲液 1000ml Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/L EDTA 20ml
4. 10%次氯酸钠 5. 氯仿:异戊醇(V:V,24:1) 6. 70%乙醇 7. 溶液I:50 mmol/L葡萄糖,25 mmol/L Tris.HCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA(pH8.0)100ml
8. 溶液III:60ml 5mol/L乙酸钾,11.5ml 11.5%冰乙酸,28.5ml无菌水100ml 9. 溶液II:分别配制0.4 mol/L NaOH和2%SDS溶液(各30ml),用时1:1混合 10. LB液体培养基 实用文档 文案大全 配制每升培养基,应在950mL去离子水中加入: 胰蛋白胨(bacto-typtone) 10g 酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解,加入200uL 5mol/L NaOH调节pH至7.0,加入去离子水至总体积为1升,121℃高压灭菌20分钟。
11. MS基本培养基 大量元素 mg/L 微量元素 mg/L 有机营养 mg/L NH4NO3 1650 KI 0.83 甘氨酸 2.0 KNO3 1900 H3BO3 6.2 烟酸 0.5 CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3 盐酸吡哆醇(Vb6) 0.5 MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 8.6 盐酸硫胺素(Vb1) 0.l KH2PO4 170 NaMoO4·2H2O 0.25 肌醇 100 CoCl2·6H2O 0.025 CuSO4·5H2O 0.025 FeSO4·7H2O 27.8
配制方法 母液: 大量元素(50×) 400mL 硝酸铵 33g;硝酸钾 38g;磷酸二氢钾 3.4g;七水合硫酸镁 7.4g; 铁元素(100×) 200mL 七水合硫酸亚铁 0.556g;七水合EDTA二钠 0.746g; 有机营养(100×) 200mL Gly 0.040g;VB1 0.002g;VB6 0.010g;肌醇 2g;烟酸 0.010g; 实用文档 文案大全 微量元素(1000×) 200mL 碘化钾 166mg;硼酸 1240mg;一水合硫酸锰 3380mg;七水合硫酸锌 1720mg;二水合钼酸钠 44mg;五水合硫酸铜 5mg;六水合氯化钴 5mg;
氯化钙(50×) 400mL 氯化钙8.8g 12. 愈伤组织诱导与分化培养基:MS基本培养基 + 0.2mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA + 3%蔗糖 + 0.6%琼脂
其中6-BA 取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL; NAA取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL; 2,4-D取50mg用少量1M NaOH溶解后定容到100mL; 以上激素母液均为0.5mg/mL 13. 筛选培养基:MS基本培养基+0.2mg/L 6-BA + 0.02mg/L NAA+3%蔗糖+0.6%琼脂+100mg/L羧苄青霉素
14. 抗生素母液的配制 KANA(50mg/mL) 1g KANA溶于20mL蒸馏水; RIF(50mg/mL) 0.25g RIF溶于少量乙醇再定容至50mL; STR(30mg/mL) 0.6g STA溶于20mL蒸馏水; 羧苄青霉素(100mg/mL) 2g羧苄青霉素溶于20mL蒸馏水。 潮霉素B(50mg/mL) 可以直接购买 〖实验步骤〗 I 烟草外植体的无菌培养和诱导再生
1. 烟草叶片预培养: 取烟草完全展开的幼叶,用自来水洗净晾干。在超净工作台中将叶片浸于70%酒精中30秒,然后移入10%的次氯酸钠溶液中5~10分钟(消除外植体表面的微生物)。无菌水至少洗涤3次(消毒液对外植体有很大伤害,必须清洗干净),每次停留3~5min。将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘。 实用文档 文案大全 2. 烟草叶片的诱导再生:自行设计MS培养基中的NAA、6-BA植物激素浓度,诱导烟草叶片生根或生芽;将上述处理过的无菌叶片接种在含有不同浓度植物激素的MS固体培养基中,每周定期观察并更换培养基。 II 转基因烟草的培养
1. 农杆菌的培养:将含T-DNA载体的农杆菌单菌落接种到20ml LB液体培养基中(Kana 50ug/ml、RIF、STR), 27℃,180r/min振摇培养过夜。将2ml菌液转入20ml LB液体培养基中,与上述的相同条件培养6小时左右,使菌液达到OD600=0.2~0.5,用来侵染烟草叶片 。
2. 烟草叶片预培养: 取烟草完全展开的幼叶,用自来水洗净晾干。在超净工作台中将叶片浸于70%酒精中30秒,然后移入10%的次氯酸钠溶液中5~10分钟(消除外植体表面的微生物)。无菌水至少洗涤3次(消毒液对外植体有很大伤害,必须清洗干净),每次停留3~5min。将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘。
3. 愈伤组织转化:在80r/min摇床上旋转浸染5~10分钟。将叶外植体置于无菌滤纸上吸去多余的菌液(如果叶片粘附细菌过多,可以在无菌水中漂洗1~2次)。
4. 共培养:将侵染过菌液的叶片接种在MS愈伤组织诱导和分化培养基上,在26℃黑暗条件下共培养3天。
5. 筛选培养与分化:将共培养处理的烟草叶片转移到凝固后的筛选培养基上(100ug/L羧苄青霉素和50ug/L潮霉素B,羧苄青霉素起到抑制农杆菌生长的作用。如果农杆菌生长未被抑制,农杆菌将抑制叶外植体的生长)。每隔3~4天继代一次,培养条件为,光照2000lx,温度26℃,日照16h。4周后转基因细胞分裂生长形成大量愈伤组织并有根、芽分化。接种烟草叶片于无激素的MS培养基上培养,培养条件同上,同时作为对照实验(无愈伤组织生长和器官分化)。
Ⅲ 转基因烟草的检测 1. 剪取培养后的转化烟草和前期实验未转基因烟草叶片小片,液氮中研磨至粉末状,加入0.5mL65℃预热CATB抽提液65℃水浴抽提30min,间歇混匀;
2. 取上清各加入0.5mL氯仿异戊醇(体积比24:1)去除蛋白,12000rpm离心10min;