细胞爬片免疫组织化学染色注意事项

免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。

在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。

免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。

直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。

目前通常选用免疫酶组化间接染色法。

三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。

免疫组化染色的操作技巧和注意事项【摘要】目的本院对免疫组化染色过程中存在的问题及对策进行深入的探讨以及仔细的分析。

方法自从2010 年6 月~2011 年7 月期间, 本院共收治免疫组化染色标本患者有200 例, 对其中存在问题的60例患者标本进行了仔细的分析, 并且要提出科学的应对措施。

结果本院对疫组化染色过程提出了主要的积极应对措施和科学的建议。

结论对于每一个步骤以及环节, 都会影响到染色的最终后果, 对此, 要尽量避免在染色过程中会出现一些问题, 会使免疫组化染色的质量有所提高。

【关键词】免疫组化；技术方法；质量控制；抗原修复；原因分析对于免疫组化(IHC) 技术在上世纪的80 年代之后, 在我国就迅速的开展, 至今已经有20 年快速发展的历程, 现在已经逐渐的成为病理科工作中主要的组成要素。

综合性操作技术主要是导致免疫组化, 这样会使其反应步骤增加, 出现复杂的影响因素, 技术员在基础技术上的操作要求是相对较高的, 对免疫组织学习要进行不断的提高, 了解这种技术在病理诊断方面是主要的辅助方式, 在对疾病诊断、分析、预后以及指导临床个体化治疗等方面, 都有着主要的作用。

在免疫组化的技术方面, 也存在着各种实质性的问题, 收治免疫组化染色标本200 例, 其中有60 例标本存在着问题, 本院对其进行仔细的分析, 并且提出相应的科学对策治疗方式。

1 免疫组化染色不理想的原因分析及改进措施1. 1 由于大分子的化学结构相对稳定, 它在水中呈现胶状体, 不易被机体破坏或排除, 这样在体内存留时间就很长, 有利于持续刺激淋巴细胞。

抗体是人体抵抗感染的一种重要武器, 抗体是人或动物受抗原物质刺激后, 由浆细胞合成和分泌的一种特异性蛋白质, 并具有疏水性, 因此当对抗体进行稀释时可降低它的疏水性, 当pH 接近抗体的等电点时, 抗体的疏水性能十分巨大。

1. 2 抗体与抗原的交叉反应抗原是一类能诱导免疫系统发生免疫应答, 并能与免疫应答的产物发生特异性结合的物质；抗体是人或动物受抗原物质刺激后, 由浆细胞合成和分泌的一种特异性蛋白质。

免疫组织化学染色知识点
免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，简称IHC）是在组织切片或细胞制片的基础上，通过利用特异性抗体与细胞或组织中特定分子间的特异性结合反应，以染色或标记方式来检测目标抗原的一种检测技术。

以下是免疫组织化学染色的一些基本知识点：
1. 抗体选择：根据实验目的选择合适的抗体，一般选择单克隆或多克隆抗体。

抗体可以是来自同种或异种动物，也可以是人源化的。

2. 组织或细胞预处理：包括固定、脱脂、脱水和切片等步骤，目的是保持组织或细胞的形态和结构完整，同时提高抗体的进入性。

3. 抗原解表：染色前需进行抗原解表处理，去除组织或细胞中的内源性酶等物质，以提高抗体的结合效率。

4. 特异性抗体结合：将经过解表处理的组织或细胞与选择的特异性抗体反应，抗体与目标抗原结合形成免疫复合物。

5. 二抗结合：特异性抗体结合后，使用与该抗体结合的二抗（常为抗种属免疫球蛋白）进行结合，放大信号。

6. 染色反应：根据具体实验的需要，可以选择不同的染色反应方法。

常用的染色方法有酶标法（如辣根过氧化物酶染色法，碱性磷酸酶染色法等）和免疫荧光染色法。

7. 结果观察和分析：观察染色结果，可以通过显微镜观察染色位置和程度，分析目标抗原在组织或细胞中的分布情况。

8. 数据分析和结果解读：根据染色结果，进行数据统计和分析，并结合实验设计和背景知识进行结果解读和推断。

总结：免疫组织化学染色是一种用于检测组织或细胞中特定抗原的技术，通过选择合适的抗体、预处理样品、特异性抗体结合、染色反应等步骤，可以获得目标抗原的位置和分布情况，并通过数据分析和结果解读来获取有效的实验结果。

简述免疫组化实验流程及注意事项English Answer:Immunohistochemistry (IHC) is a powerful technique used to visualize the expression and localization of specific proteins within tissue sections. It involves the use of antibodies to bind to the target protein, followed by enzymatic detection to produce a colored precipitate.IHC Experiment Workflow:1. Tissue preparation: Tissue samples are fixed, dehydrated, and embedded in paraffin wax or frozen for optimal preservation.2. Sectioning: Thin tissue sections (typically 5-10 μm thick) are cut using a microtome and mounted on slides.3. Deparaffinization and rehydration: Paraffin-embedded sections are deparaffinized with xylene or other solventsand rehydrated through a graded series of ethanol solutions.4. Antigen retrieval: Certain antigens may requireheat-induced or enzyme-induced antigen retrieval to expose their epitopes.5. Blocking: Non-specific binding is blocked using a blocking solution, such as bovine serum albumin or goat serum.6. Primary antibody incubation: The specific primary antibody is applied to the tissue section and incubated to allow binding to the target protein.7. Washing: Excess unbound antibody is removed by washing with a buffer solution.8. Secondary antibody incubation: A secondary antibody conjugated to an enzyme (such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase) is added to bind to the primary antibody.9. Washing: Excess secondary antibody is removed by washing with a buffer solution.10. Chromogenic substrate application: A chromogenic substrate is added to the section, which reacts with the enzyme bound to the secondary antibody to produce a colored precipitate.11. Counterstaining: The tissue section is counterstained with a dye, such as hematoxylin, to provide contrast and cellular visualization.12. Mounting: The stained section is mounted with a coverslip for preservation and examination.注意事项：Use high-quality antibodies specific for the target protein.Optimize antibody concentrations and incubation times to achieve optimal staining results.Control for non-specific staining by using appropriate negative controls.Interpret results with caution, considering factors such as tissue preparation, antibody specificity, and staining intensity.中文回答：免疫组化实验流程：1. 组织制备，对组织样本进行固定、脱水、包埋于石蜡中或冷冻，以获得最佳保存效果。

这是针对细胞爬片的免疫荧光染色标准步骤：
1）实验前一天，将细胞接入铺有22×22mm（或24×24mm）盖玻片的六孔板中。

2）第二天，待细胞汇合度达到70％左右开始进行染色步骤。

3）用新鲜配制的2％（或4％）多聚甲醛固定细胞10分钟。

4）PBS洗三遍，每次5分钟。

5）用0.2-0.5％ triton X-100（PBS配制）对细胞透化处理10分钟。

6）PBS洗三遍，每次5分钟。

7）2％BSA或者10％二抗同源血清（注意一定要是正常血清）封闭30分钟，PBS 洗两遍。

8）加入1抗，室温孵育1 小时。

9）PBS洗三遍，每次5分钟。

10）加入二抗，室温孵育30-45 分钟。

11）PBS洗四遍，每次5分钟。

12）加入0.5 ug/ml DAPI（PBS配制）染色10分钟（这里也可用其它的染核染料如hoechst 33258）。

13）用PBS洗三遍，去除多余的DAPI。

14）加入20 ul封片剂封片。

15）封片好的细胞样品可于4度冰箱中存放2周以上。

注意步骤5-7在某些蛋白的染色步骤中可能不是必须的，一抗如果有多种（但注意要是不同种属的）可以同时孵育，二抗同时使用时最好是同一种属来源（如驴抗兔，驴抗羊，驴抗鼠），以避免二抗间的交叉反应。

如果是组织切片样品，可能还涉及到样品的染色前处理（比如石蜡切片的脱蜡），请参阅其它的说明，但荧光染色步骤是一样的。

如果要做细胞涂片的免疫荧光染色，需用离心涂片机将细胞固定在玻片上，再进行后续步骤。

免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。

如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。

就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。

2、免疫组化最大的优势是定位和定性。

相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。

尤其对于有些因子的转位研究十分有用。

3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。

免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。

4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。

阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。

前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。

5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。

如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。

当然也不能做假阳性或假阴性结果。

6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。

我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。

失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。

细胞免疫组化细胞爬片的免疫组化1. 细胞爬片，5 天后进行免疫细胞组织化学染色定。

2. PBS 清洗标本3 次各1 min 。

3 .冰丙酮固定15 min（或4%多聚甲醛固定30min）。

4. 空气干燥5min 。

5. PBS 清洗标本3 次各2 min 。

6. 0.5%Triton X-100（ DPBS 配）孵育1 次20min 。

7. PBS 清洗标本3 次各2 min 。

8 .3%H2O2 （试剂A）孵育15 min。

9. DPBS 清洗标本3 次各2 min 。

10. 封闭血清孵育（试剂B）20min 。

11 .一抗孵育（滴度1: 200,湿盒）4C 过夜或37 C 60 min阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS 液12. PBS清洗标本3次各5 min。

13 .二抗工作液孵育（湿盒试剂C）37 C 30 min。

14 .PBS 清洗标本3 次各5 min。

15. 试剂D （湿盒）37 C 30 min。

16、PBS 清洗标本3 次各5 min 。

17、DAB 显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min 18、蒸馏水洗2 次 1 min 。

19、苏木素复染0.5~1min 。

20、自来水洗返蓝。

21. 梯度酒精脱水75，85，95，100%各3min 。

22. 二甲苯透明2 次3min 。

23、中性树胶封片。

注意事项：1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：a对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片；b接种的细胞密度适中以2*104/ml为宜，若密度太高5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C 冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。

3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜5、Triton X-100 表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。

细胞染色注意事项细胞染色是细胞学中最常用的技术之一，通过染色剂和特定的实验步骤，可以使细胞的不同结构和组分显色，从而进一步研究和观察细胞的形态、结构和功能。

然而，细胞染色是一项精细而复杂的实验技术，需要注意一些细节才能取得准确和可靠的结果。

以下是进行细胞染色时需要注意的几个方面：1. 样品准备：- 细胞的健康和适应性对染色结果至关重要。

细胞培养应选择低 passage 数的细胞，并保证细胞处于良好的形态和状态。

- 细胞密度应适中，不宜过于稀疏或过于密集。

过于稀疏的细胞染色结果可能不明显，而过于密集的细胞染色结果可能相互重叠，难以辨认。

2. 染色剂选择：- 根据所需染色的细胞结构和组分选择合适的染色剂。

常用的染色剂有伊红、溴菊花素、卡罗林、吲哚蓝等。

- 注意染色剂的选择和浓度。

染色剂浓度过高可能导致结构过度显色、阴影过重，而浓度过低则会使细胞结构显色不明显。

3. 固定和渗透：- 细胞染色前需要对样品进行固定和渗透的处理。

固定可以保持细胞的形态和结构，常用的固定剂有甲醛、乙醛等。

渗透则有助于染料进入细胞内部，增加显色效果。

- 固定和渗透的时间应根据具体染色剂和细胞类型进行优化，一般可在实验室常见的固定和渗透时间范围内进行尝试。

4. 清洗和封片：- 染色完成后，应对样品进行充分的清洗，以去除多余的染料和其他杂质。

清洗次数和时间应根据染色剂的性质进行调整。

- 最后，将细胞样品封片以固定染色结果和保护样品。

封片时应注意尽量避免产生气泡和样品的脱落。

5. 显微镜观察：- 染色完成后，应利用显微镜对染色结果进行观察和记录。

显微镜的放大倍数和对焦应根据样品的染色结果进行调整。

- 对于多通道染色，还需要进行合适的通道选择和重叠观察，以获得更全面的细胞信息。

综上所述，细胞染色是一项需要仔细操作和精确控制的实验技术。

在进行细胞染色时，应注意样品的准备、染色剂的选择和浓度、固定和渗透的时间、清洗和封片的步骤以及显微镜观察等细节。

免疫组织化学技术：染色步骤免疫组织化学技术:染色步骤一、免疫荧光法１．直接法（1）冰冻切片、涂片、印片或单层细胞培养物按要求进行固定，石蜡切片常规脱蜡后用酶消化处理，然后水化，用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分钟，冷风吹干，放入湿盒中。

（2）滴加经稀释的荧光抗体，37℃ 30-60分钟或4℃过夜（3）PBS 洗2次，蒸馏水洗1次（4）50%甘油缓冲液封片（5）荧光显微镜下检查（6）对照染色①阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性。

②阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。

③空白对照，用免去特异性抗体或用PBS替代特异性抗体，结果应为阴性。

④抑制试验，将标记抗体(例荧光抗体)和未标记的抗体或血清等量混合后，按上述步骤处理切片，结果应为阴性（一步法）。

或将待检切片两张，一张加未标记特异性血清，另一张加未标记同种正常血清，孵育后冲洗，再加入标记的特异性血清（例如特异性荧光标记抗体），加了未标记特异性血清的切片因抗原抗休已结合，故染色被抑制，呈阴性结果，而加同种正常血清的切片则呈阳性反应（二步法）。

对照染色非常重要，开始试验时应做全面对照，每次试验时应做阳性和阴性对照。

2．间接法（1）标本处理同直接法。

（2）滴加适当稀释的特异性抗体于标本上，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟或４℃过夜。

（3）滴加适当稀释的间接荧光抗体，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟。

（５）ＰＢＳ洗２次，双蒸水洗１次。

（６）甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察。

（７）对照染色：可用空白对照和阴性对照等。

３．补体法（１）标本处理同直接法。

（２）滴加适当稀释的特异性抗体及补体的等量混合液，置湿盒中，３７℃３０分钟，ＰＢＳ洗３次。

（３）滴加适当稀释的抗补体荧光抗体，置理盒中，３７℃３０分钟。

ＰＢＳ洗２次，蒸馏水洗１次。

（４）甘油缓冲液封片。

（５）对照染色，可作正常血清替代，灭活补体对照即经５６℃３０分钟灭活处理后，将灭活的补体与特异性抗体等量混合，进行染色，结果均应阴性。

细胞爬片免疫荧光染色步骤以下是十条关于“细胞爬片免疫荧光染色步骤”的内容：
1. 嘿，先得准备好细胞爬片呀，这就像给细胞搭个小舞台一样重要！你想想，没有好的舞台，细胞怎么能好好表演呢？
2. 然后嘞，固定细胞可不能马虎！这就好比给细胞来个定格，让它们乖乖待着别动，不然怎么染色呀，对吧？
3. 接下来，透化这一步可不能忘！这就像给细胞打开一扇门，让染色剂能顺利进去和它们亲密接触。

4. 哇哦，一到抗体孵育这步就超关键啦！就好像给细胞穿上特制的衣服，让它们变得与众不同。

5. 洗去多余抗体也很重要呀，不然乱七八糟的可不行，这就跟打扫房间一样，得把多余的垃圾清理掉嘛。

6. 再接着，染荧光这步可太神奇啦！就像是给细胞点上了闪耀的星光，让它们瞬间璀璨起来。

7. 封片这一步也不能小瞧哦！这就像是给细胞的小世界加上一层保护罩，让它们安安稳稳的。

8. 哎呀，观察的时候可激动啦！你能看到细胞变得美美的，就像看到了一场华丽的表演，不是吗？
9. 整个过程中，每一步都要细心再细心呀！这就像搭积木，一个不
小心就可能前功尽弃哦。

10. 所以说呀，细胞爬片免疫荧光染色步骤可真不简单，但只要认真做，就能看到超棒的结果！
我的观点结论：细胞爬片免疫荧光染色步骤需要严谨对待，每个环节都很重要，只有认真操作才能获得理想的染色效果。

细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。

凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。

它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。

细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。

在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。

在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。

核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。

如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。

相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。

细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。

一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。

三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。

研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。

本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。

细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤1.爬片的准备1)爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；用盖玻片时，可根据自己的需要用小砂轮或玻璃刀剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；2)将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，然后置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后高压消毒。

高压消毒后取出放入烘箱中烘干，烘干后可放入超净台中备用。

3)可将爬片用多聚赖氨酸处理，以使细胞与爬片结合更牢固。

1mg/ml的多聚赖氨酸用0.22um的滤器过滤除菌后分装于经过无菌处理的1ml细胞冻存管内保存在4℃里，三个月内仍然可以使用。

用时将高压灭菌过的爬片放到0.1mg/ml的多聚赖氨酸溶液内浸泡5min，无菌晾干即可（放入培养板孔内注意爬片的正反面）。

或将爬片铺于培养皿中，将多聚赖氨酸溶液滴于爬片上，室温10分钟后，吸除玻片上的溶液，在超静台内晾干后使用。

储存、稀释和吸取多聚赖氨酸要使用塑料制品。

2.细胞爬片1)胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中，充分吹打，使之成单细胞悬液，计数。

2)根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内。

滴加细胞悬液时，根据爬片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，然后将爬片置于液滴上，压紧，使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，防止加细胞悬液时爬片漂起，造成双层细胞贴片。

若细胞贴壁能力不强，爬片可经多聚赖氨酸浸片后放入。

3.细胞的固定及免疫荧光1)在培养板中培养好细胞后，吸除培养基，一般先使用PBS轻洗细胞2×3 min，然后再做固定（凋亡的TUNEL染色等可以不清洗）。

2)固定：加入4%多聚甲醛(PBS配制)固定20分钟。

如果暂时不能立即做组化检测，使用含0.4%多聚甲醛的PBSPH7.4浸泡细胞（注意在免疫组化检测完成前不要让细胞变干，否则细胞收缩形态不好）。

3)除去多聚甲醛，使用PBS轻洗细胞3×3 min。

良好的免疫组化染⾊切⽚是正确判断染⾊结果的基础和前提。

由于免疫组化染⾊过程中存在很多步骤或环节，每⼀个步骤或环节都可能影响到染⾊的最终结果，因此，要做好⼀张⾼质量的免疫组化切⽚并不是⼀件⾮常容易的事。

需要病理技术员和病理医⽣密切配合、相互协调、共同努⼒才能保证做出合格的免疫组化切⽚。

虽然免疫组化染⾊可以存在各种各样的问题，但从染⾊的结果看，⼀般可分为两类：⽆⾊⽚（即⽆阳性信号）和"杂⾳"染⾊⽚（有阳性信号）。

⼀、⽆⾊⽚ 染⾊结束后，切⽚中见不到任何阳性信号。

这是常规⼯作中⽐较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染⾊过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。

2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。

假阴性结果⼜可分为两种情况：（1）、切⽚中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。

出现这种情况，要麽是病理医⽣选择错了切⽚或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。

获得正确的切⽚进⾏染⾊是获得正确结果的前提。

由此表明：制作出合格的免疫组化切⽚不仅仅是技术员的事，病理医⽣也起着不可缺少的作⽤。

（2）、染⾊过程中的某⼀或某些环节出了问题。

⽐如，组织未进⾏抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选⽤了只能⽤于冰冻组织⽽不能⽤于⽯蜡包埋组织的抗体；或⼀抗失效，虽然抗体失效在理论上是⼀个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不⽤和/或已超过有效期是主要的原因。

也可见于染⾊过程中漏掉了某⼀环节，如忘记加⼆抗或三抗，或⽤了两次⼆抗⽽缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。

为了避免这种简单的错误，有⼀种简单的⽅法：在三抗孵育结束时，将切⽚上的三抗甩在⼀张⽩纸上，在将配制好的DAB滴⼀滴在⽩纸的三抗上，观察是否出现棕⾊。

如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。

如果这种DAB再滴到切⽚上没有出现任何阳性信号，问题⼀定是出在三抗以前。

如果纸上不出现棕⾊反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。