CFX 96定量操作工作报告
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CFX96操作工作报告
一 仪器的工作条件：助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。
稳定的电源（可配稳压器）、通风、温度控制在10-30℃、实验室干净安全
二 启动和关闭仪器
打开电脑→打开定量PCR仪底座开关→启动CFX Manager 软件
开机：待仪器开机后完成自检后再进行操作（先开机再开软件）。
关机：待仪器运行完程序后，实验结束后取出反应管，顺序关闭CFX Manager
软件、定量 PCR 仪电源，关闭电脑，关机后切断仪器电源。
开关盖：CFX仪器上盖部分为全自动控制，在通电状态，严禁任何人为干涉上盖
开启或关闭的行为，此类行为会导致上盖故障，危及仪器使用。正常的开关机顺
序有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。
三 样品和模版的要求：
1 保证RNA的质量（完整性和纯度）。
2 RNA反转录的效率和一致性。
3 引物的设计要求：长度在75-300bp间，GC含量在50-60%，退火温度在55-60℃，
建议使用Primer-Blast程序和MFOLD程序设计。
四 实验操作的要求：
（1） PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用
的PCR实验室。
（2） 纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得
到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
（3） 所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套、口罩，
勤换手套。
（4） PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水（dd水），采用高压灭菌。
（5） 试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应
洗涤干净并高压灭菌。
（6） PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀 。
（7） 专用移液器，要求加样精准，移液器定期校正。
（8） 样品放置：将PCR反应体系加入到0.2ml低缘八联管，盖上管盖；或加入
低缘96孔板，用光学级封膜封好。注意，必须带一次性塑料手套，不要
让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。
（9） 为了最小化实验结果的统计学偏差，先制备混合反应液，所有样本有三个
重复。大剂量包装的反应试剂，使用前进行分装（引物、模板，水），尽
量减少试剂的反复冻融。
（10）加入试剂之前， 混匀一下后瞬时离心，以免放置时间长了浓度不均匀。
（11）无论探针法还是染料法，每次试验都要做NTC（No Template Control），
以验证有无污染发生。
五 样品放置
将PCR 反应体系加入到0.2ml 低缘八联管，盖上管盖；或加入低缘 96孔板，
用光学级封膜封好。注意，必须带一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表
面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。
六 设置程序，运行实验
定量PCR软件操作基本步骤为：a.设置热循环程序文件（Protocol Tab）b. 设
置反应板文件（Plate Tab）。 C.点击“Start Run”键，运行程序 。
（1）热循环程序文件（Protocol Tab）设置指南：点击 Edit（编辑）或 Create
New（创建新程序）。
（2）反应板设置文件（Plate Tab）设置指南：选择本次实验所要使用的荧光染
料种类；单击样品类型；如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品
（Standard），点击“Dilution Series”键可设置其标准品浓度及稀释倍数。
（3）点击“Start Run”键。单击openlid（打开热盖）或Close lid（关闭热
盖）放置样品；单击Start Run，保存文件，开始运行程序。
七 结果分析
（1）PCR 反应结束后，软件会自动计算标准曲线和Ct 值等。
（2）如需进行表达量分析、等位基因分析等，在软件窗口选择相应分析功能。
（3）点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告单
八 退火温度的摸索
首先应该确认或摸索出内参基因和靶基因的最佳退火温度
九 标准曲线的建立：
5-10倍梯度稀释模版，确保覆盖实验中所用到的模版浓度，每对引物重复3次，
确定qPCR的反应效率，评估扩增效率和数据的回归曲线程度。扩增效率应该在
90%-105%，R>0.990。
十 数据分析：
1 实验应该设置3个生物学重复和3个技术性重复，还需要设计NTC和NRT。
2 内参基因应该在不同实验条件、不同样本和时间上表达水平一致，Cq值的差
异不超过0.5。
3 技术性重复的Cq值的差异不超过0.5
4 相对定量的计算方法：2–∆∆CT和∆CT法。
