引物设计
一、软件使用：
l 推荐软件：Primer Premier 5.0
l 优点：操作简单、显示各种参数改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等 l 缺点：没有明显缺点
l 本地同类软件：DNAClub ；Oligo 6.22；Vector NTI Suit ；Dnasis ；Omiga ；Dnastar ；DNAMAN (Lynnon
Biosoft, Quebec, Canada).
l 网上同类软件：Primer3（Whitehead Institute 开发）；JaMBW （European Molecular Biology
Laboratory of Heidelberg 开发）。http://210.72.11.60网站已引进并调试好这两种软件。独特之处在于：对全基因组PCR 的引物设计，可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用。
二、推荐操作：
l 引物搜索：Primer Premier 5.0 l 引物评价：Oligo 6.22
三、引物设计的原则:
首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA 聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length ）、产物长度（product length ）、序列Tm 值(melting temperature)、ΔG 值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin ）、错误引发位点（false priming site ）、引物及产物GC 含量（composition ），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：
1.
引物的长度一般为15-30bp ，常用的是18-27bp ，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74
℃，即Taq 酶的最适温度。
2. 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A （3’端碱基序列最好是G 、C 、CG 、GC ），因为A 在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能
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导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
3.
引物的GC 含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC 含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果G-C 比例超出，则在引物的5’端增加As 或Ts ；而如果A-T 比例过高，则同样在5’端增加Gs 或Cs 。但也有认为：原来普遍认为PCR 引物应当有50%的GC/A T 比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA 为模板，用81%A T 的引物可以产生单一的、专一的、长250 bp ，含有70% A T 的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR 引物的GC/AT 比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT 比。
4.
引物所对应模板序列的Tm 值最好在72℃左右。（Tm 值曲线以选取72 度附近为佳，5’到3’的
下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在55－80℃之间 5.
ΔG 值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG 值最好呈正弦曲线形
状，即5’端和中间ΔG 值较高，而3’端ΔG 值相对较低，且不要超过9（ΔG 值为负值，这里取绝对
值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。3′末端双链的ΔG 是0～－2 kcal/mol 时，PCR
产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、
而－10时接近于0。 6.
可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，
错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。但对于特定的模板序列，
还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以
上，而在错误位点的引发效率为130，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受
的。
7.
Frq 曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用
Frq 值相对较低的片断。 8.
引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度
从而导致PCR 正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG 或
CCC 会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环，其ΔG 为－3 kcal/mol 的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。
9.
以公式(4×G/C + 2×A/T –5)计算Tm 值，即退火温度。选择较低Tm 值的引物的退火温度为反应的退火温度。4-6℃的差别似乎对PCR 产量影响不大。最好，保证每个引物的Tm 值相匹配，且在70-75
℃范围内
10.
要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR 的效率
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